Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Il cervello umano è composto di circa 10¹⁴ sinapsi. Numero di sinapsi è strettamente regolato durante lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso centrale (CNS). Durante lo sviluppo, il numero di sinapsi è modulata da sinaptogenesi e potatura per formare reti di un neurone funzionali. Apprendimento e memoria sono supportati dal regolamento del numero di sinapsi e forza, un processo conosciuto come potenziamento sinaptico e depressione¹. D'importanza, la stabilizzazione delle sinapsi mature è essenziale per il mantenimento di connessioni di rete neuronale. Inoltre, i deficit nella densità sinaptica sono stati segnalati nelle fasi iniziali di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio)². Pertanto, la capacità di identificare accuratamente e valutare il numero di sinapsi è fondamentale ai fini della valutazione della patologia e fisiologia del cervello.

La massima densità e natura compatta delle sinapsi rendono difficile per stimare il loro numero preciso nelle aree del cervello intatto. Sinapsi chimiche nel SNC sono costituite da due neuroni nell'apposizione vicina, separati da un cleft sinaptico³. Il terminale pre-sinaptica, o bouton sinaptico, emerge da un assone e consiste di vescicole accumulate, che contengono i neurotrasmettitori che definiscono la specificità di una sinapsi — vale a dire, glutammato e acido gamma - aminobutirrico (GABA) per eccitanti e inibitorio sinapsi, rispettivamente. Le membrane delle vescicole contengono vescicolari trasportatori specifici per ogni neurotrasmettitore: trasportatore vescicolare glutammato (vGlut) per il glutammato e il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT) per GABA. Il terminale post-sinaptico è una struttura molto densa composta da diverse proteine, tra cui i recettori, molecole di adesione e proteine impalcatura. In sinapsi eccitatorie, proteina di densità-95 post-sinaptica (PSD-95) è il più abbondante dell'impalcatura proteina⁴, modulante eccitanti N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e recettore di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) funzione, considerando che gephyrin ancore recettori inibitori al terminale post-sinaptico inibitorio⁵. Nel complesso, la specificità delle proteine ai compartimenti pre- e post-sinaptici aiuti la differenziazione e identificazione di sottotipi di sinapsi.

La valutazione del numero di sinapsi può essere eseguita con diverse tecniche. Il più comune è l'uso di microscopia elettronica (EM), che consente l'analisi della sinapsi in aree cerebrali compatta e intatta con alto ingrandimento e risoluzione. Tuttavia, questa tecnica è molto costosa, richiede preparazione del campione complicato e richiede molto tempo. Altre tecniche includono l'uso della matrice tomografia⁶, che ha un grande svantaggio in quanto richiede attrezzature specializzate e costose per eseguire l'analisi. Inoltre, linee transgeniche che esprimono specifici marcatori sinaptici sono utili a valutare la sinapsi numero⁷, ma la generazione di nuove linee può essere restrittiva e costoso, e la sovraespressione di proteine può causare indesiderato fuori bersaglio fenotipi.

A causa di queste limitazioni e per semplicità, molti ricercatori valutano numero di sinapsi esaminando i livelli della proteina sinaptica totale. Tuttavia, la perdita di sinapsi può essere osservato prima di cambiamenti sostanziali nella proteina, come risultati rimodellamento sinaptici strutturali nella dispersione di apposizione pre- o post-sinaptica, con Nessuna degradazione di proteine sinaptiche. Inoltre, in annuncio, i livelli della proteina sinaptica sono ridotti seguente sinapsi degenerazione o morte di un neurone^8,9. La quantificazione dei livelli totali non consente questa distinzione. Così, c'è la necessità di sviluppare un metodo affidabile, accessibile e accurato per la valutazione del numero di sinapsi nel cervello.

In questo articolo, descriviamo come accuratamente identificare e determinare il numero delle sinapsi usando la microscopia di immunofluorescenza nelle fette hippocampal del cervello del roditore. Le sinapsi sono definite dalla colocalizzazione di marker pre- e post-sinaptico che appaiono in una distribuzione punctata. Dimostriamo la validità di questa tecnica attraverso lo studio di Wnt segnalazione nel cervello. WNT sono proteine secrete importanti per la formazione, la eliminazione e la manutenzione delle sinapsi. L'induzione in vivo di un antagonista secreto della cascata della Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), porta alla perdita sinaptica eccitatoria preservando sinapsi inibitorie nell' ippocampo¹⁰. Illustriamo l'identificazione e il conteggio delle sinapsi eccitatorie ed inibitorie nelle fette hippocampal da un topo adulto esprimendo Dkk1 ed evidenziare la trasferibilità di questa tecnica ad altri tipi di preparazioni di coltura di tessuti.

tutti gli esperimenti con topi e ratti sono stati approvati e condotti utilizzando le procedure di pianificazione 1 coperti sotto l'atto di casa ufficio animali (procedure scientifiche) 1986. La ricetta di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) può essere trovata nella tabella 1.

1. acuta Hippocampal Fetta preparazione

1. rimuovere il cervello del mouse più velocemente possibile, utilizzando una spatola e forbici per tagliare il cranio e inserirlo nella gelida affilate, ossigenato (95% O ₂, 5% CO ₂), alto-saccarosio ACSF (~ 100 mL).
2. Posto nel cervello del topo su una piastra di Petri e rimuovere il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi prima hemisecting giù la linea mediana del cervello.
3. Posizionare i due emisferi sul lato che è stato appena tagliato e incollare ogni emisfero sul palco di un vibratomo.
4. Tagliare 200-300 µm di spessore sezioni della regione completa di interesse. In caso di ippocampo, dovrebbero ottenere circa 3-4 fette per emisfero.
5. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica, trasferire le fette in una camera sommersa ossigenato (95% O, ₂, 5% CO ₂) ACSF. Mantenere a 34 ° C per 30 min.
   Nota: Il trattamento delle fette con attivi agenti farmacologici, quali proteine ricombinanti di Dkk1, può essere eseguito in questa fase aggiungendo gli agenti alla fetta camera.
6. Rimuovere le fette dalla camera utilizzando un pennello, inserirli in una piastra a 24 pozzetti e difficoltà per 20 min a 1 h in paraformaldeide al 4% (saccarosio PFA)/4% a temperatura ambiente (TA).
   Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.
7. Lavare le fette tre volte in 1X PBS (10 min. ciascuno).
   Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per 1-2 giorni, finché le fette sono conservate a 4 ° C in 1X PBS.

2. Immunofluorescenza per marcatori sinaptiche

Nota: le ricette di tutti i buffer utilizzati possono essere trovate nella tabella 2.

1. Sostituire il PBS con tampone di blocco/permeabilizing (tabella 2) nei pozzetti fetta e incubare a temperatura ambiente per 4-6 h.
2. Diluire l'anticorpo policlonale cavia contro vGlut1 1:2,000 il fattore di diluizione nel buffer blocco/permeabilizzazione.
   Nota: vGlut1 è un indicatore per la pre-sinaptica eccitatoria visualizzazione terminal. Per l'identificazione di sinapsi eccitatorie post-sinaptiche, utilizzare un anticorpo policlonale contro PSD-95 e diluito 1: 500 nella stessa soluzione. Utilizzare un volume minimo di 300 µ l in ogni pozzetto. Per identificare la posizione anatomica dell'ippocampo, utilizzare un anticorpo che può anche identificare la struttura neuronale, come MAP2 o tubulina. Lavorare fuori le concentrazioni corrette di tutti gli anticorpi primari per i marcatori sinaptici di scelta (pre- e post-sinaptico) e diluito in tampone fresco blocco/permeabilizing.
3. Incubare le fette nella soluzione anticorpo primario durante la notte (o per 1-2 giorni) a 4 ° C. uso a scuotimento con vigoroso movimento.
4. Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).
5. Diluire la 1: 500 appropriati anticorpi secondari in tampone bloccante. Ad esempio, quando si utilizza l'anticorpo di cavia vGlut1, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di cavia (ad es., asino anti-porcellino d') coniugata ad un fluorophore specifico. Quando si utilizza l'anticorpo di coniglio di PSD-95, applicare un anticorpo secondario che riconosce la componente di coniglio (ad es., anti-coniglio di asino) coniugata ad un fluorophore specifico diverso.
6. Incubare le fette in questa soluzione per 2-3 h a RT. Accertarsi che le fette siano protetti dalla luce, come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.
7. Lavare le fette tre volte in PBS (10 min. ciascuno).
8. Attentamente togliere le fette dalla piastra 24 pozzetti utilizzando un pennello e metterli in modo uniforme su vetrini pre-etichettate. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni fetta e quindi posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti sopra le fette. Evitare la formazione di bolle d'aria. Fate attenzione ad per usare abbastanza liquido di montaggio (300-400 µ l), come una quantità insufficiente può portare a secco fette.
9. Lasciare asciugare per un minimo di 1-2 giorni a RT e mantenere le diapositive al riparo dalla luce.
10. Archiviare le diapositive a 4 ° C nel breve termine, ma per l'archiviazione a lungo termine, conservare a -20 ° C.

3. Analisi e acquisizione di immagini confocal

1. Imaging mediante microscopia a scansione laser confocale.
   1. Identificare la regione dell'ippocampo essere imaged (ad es., il cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) o il giro dentato (DG)) per mezzo di un 10x o 20x obiettivo.
   2. Cambiamento di un x 40 o 63 x obiettivo a immersione in olio per assicurarsi che l'anatomia della fetta è intatto identificando neurites continuo e organizzato la struttura. Utilizzare un indicatore di un neurone, quali MAP2, come riferimento ( Figura 1A).
   3. Successivamente, passare a un 60 x obiettivo a immersione in olio (NA = ~1.3 - 1.4) e regolare le impostazioni per ciascun canale per ottenere segnale ottimale e contrasto. Impostare l'intensità di ogni laser per evitare la saturazione dei pixel di utilizzando l'opzione alto / basso contrasto.
      Nota: Queste impostazione verrà dipendono il microscopio utilizzato, ma fare riferimento alla Tabella materiali per le impostazioni di risparmio energia di laser utilizzati in Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Per risultati ottimali, utilizzare una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Le impostazioni dovrebbero rimanere costante durante le diverse condizioni dell'esperimento stesso. Zoom aggiuntivi possono essere applicati se necessario.
   4. Valutare la profondità dove la colorazione è anche e acquisire la serie di immagini di almeno 8 equidistante (250 nm) aerei. Poi prendere 3 pile adiacenti immagini rappresentative provenienti dalla stessa zona di interesse per fetta.
      Nota: La profondità può variare da una sezione a altra ma sempre dovrebbe essere circa 2-5 µm dalla superficie della fetta.
   5. Ripetere l'acquisizione in almeno 3 fette per condizione e da 6-8 animali per gruppo di trattamento.
2. Image analysis.
   Nota: Utilizzare un software di analisi di immagine automatizzato (Vedi la Tabella materiali). Si noti che alcuni sistemi richiedono una licenza, mentre altri sono gratuiti, come ad esempio ImageJ. Il software utilizzato deve analizzare le immagini in 3D tenendo conto di tutti i piani dello stack imaged. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli del software utilizzato nell'analisi di immagine ( Figura 1).
   1. Uso un protocollo di soglia di intensità abitudine-basata per identificare tutti i puncta sinaptica e indicatori di un neurone, che manualmente sono ottimizzati e selezionati all'interno del software [vedi Tabella materiali per lo specifico software utilizzato in questo protocollo].
      Nota: Il software identifica un'intensità minima e massima per ogni fluoroforo e associa una percentuale di intensità per ogni oggetto riconosciuto. Si noti che la percentuale di intensità varierà secondo il fluoroforo utilizzato e l'anticorpo contro il marcatore sinaptico.
   2. Per marcatori sinaptici, garantire che dimensione filtri (> 0.1 µm ³ e < 0.8µm ³) sono selezionati all'interno del software e applicate all'immagine. Regolare i parametri per garantire che gli oggetti selezionati non sono sovrapposte. Escludere qualsiasi oggetto che sono troppo grandi o troppo piccoli per essere considerati puncta sinaptica (Vedi Figura 2B).
      Nota: Una volta ottimizzato, gli stessi valori di soglia vengono quindi applicati a tutte le immagini all'interno di un determinato esperimento.
   3. Quantificare il numero medio, intensità e volume delle singola puncta sinaptica (pre- o post-sinaptico) utilizzando i protocolli ottimizzati soglia selezionati all'interno del software. Normalizzare il numero puncta al volume del campo dell'immagine (all'incirca 16.928 µm ³ nel sistema utilizzato qui). Normalizzare l'intensità puncta sinaptica per l'intensità del marcatore neuronale riferimento.
      Nota: Le sinapsi sono definite come la co-localizzazione tra marcatori sia pre- che post-sinaptici. Una volta i protocolli di soglia per pre- e post-sinaptico puncta hAve è stato stabilito, il software dovrebbe identificare la co-localizzazione dei puncta sinaptica come la sovrapposizione di 1 pixel o più in un unico piano.
      Nota: Per l'analisi statistica, confermare di che tutti i set di campioni seguano la normalità e l'omogeneità delle varianze, come determinato da Lilliefords e test χ2, rispettivamente. Campioni che presentano una distribuzione normale e l'omogeneità delle varianze dovrebbero essere analizzati con test parametrici, come descritto di seguito. Ad esempio, puncta sinaptica eccitatoria analisi devono essere eseguita utilizzando un one-way ANOVA con blocco e replica. Ogni singolo esperimento dovrebbe essere considerata come un blocco; in genere esistono tre esperimenti indipendenti, ciascuno con 1-3 topi da ogni condizione.

Figura 1: analisi dei puncta sinaptica utilizzando l'analisi dell'immagine software. (A) Screenshot della personalizzazione di protocollo soglia di intensità. L'esempio fornito è per PSD-95, in cui i puncta selezionato hanno una dimensione definita di > 0,1 µm ³ e < 0,8 µm ³ e presenti oggetti sovrapposti ridotta a icona. Si noti che l'immagine mostrata è per un aereo confocale abilitare la visualizzazione più facile dei puncta sinaptica e selezione dei parametri precisi. (B) Screenshot dell'analisi uscita dal software (dopo la selezione del protocollo ottimizzato). Un esempio di crudo puncta sinaptica numeri misurazioni basate sul volume. Questi valori vengono poi esportati ad un software di foglio di calcolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: controllo di qualità delle impostazioni fetta e parametro per puncta sinaptica. Immagini confocal (A) rappresentative (obiettivo 40x) della regione di interesse: il CA1 strato radiato (sr) e strato oriens (così) di una fetta hippocampal sono identificati dalla macchiatura MAP2. Barra della scala = immagini Confocal di 2 µm. (B) (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde) e PSD-95 (rosso)-da fette hippocampal. Nota l'identificazione dei puncta chiaro pre- e post-sinaptico. Puncta superiore a 0,8 µm ³ sono esclusi dalla quantificazione (frecce bianche). Barra della scala = 2 µm (C) confocale immagini (60 x obiettivo e un'ulteriore 1.3 X ingrandimento del software di acquisizione) del CA1 strato radiato, con eccitanti marcatori-vGlut1 (verde)-dal criostato-taglio sezioni hippocampal dai cervelli intero risolto in PFA. Si noti la presenza di fori grandi e irregolari, ragruppata vGlut1 colorazione. Barra della scala = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Perdita di sinapsi si presenta presto nella malattie neurodegenerative come l'annuncio e la malattia del Parkinson2,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi deficit rimangono capiti male. Le carenze nella segnalazione Wnt sono state associate AD13,14,15,16,17. WNT sono glicoproteine secrete e svolgono un ruolo essenziale nella formazione della sinapsi e la modulazione della trasmissione sinaptica18,19,20,21. Recentemente, abbiamo identificato Wnt come regolatori chiave di manutenzione sinaptica nel sistema nervoso maturo10,22. Per studiare con precisione l'impatto di segnalazione Wnt su sinapsi nell'ippocampo dei topi geneticamente modificati, abbiamo approfittato di una preparazione di fetta di cervello e microscopia confocale per valutare i cambiamenti nel numero di sinapsi. Abbiamo identificato fette sani in cui la struttura era ben conservato (Figura 2A). Inoltre, la selezione dei puncta sinaptica è stata definita con cura, con l'esclusione di grandi oggetti macchiati probabilmente rappresentano aggregati proteici (Figura 2B). Questo criterio è stato applicato a tutte le immagini, con gli stessi parametri di analisi rigoroso.

Abbiamo usato un sistema di modello transgenico che induce l'espressione dell'antagonista Wnt secreta Dkk1 in adulto di topi (iDkk1) sotto tetraciclina controllano (Vedi la Tabella materiali)10,22. Abbiamo dimostrato che il blocco di segnalazione Wnt nell'ippocampo adulto provoca perdita di sinapsi eccitatoria in particolare della regione CA1 strato radiato (Figura 3). Figura 3A illustra immagini rappresentative confocal di marker pre- e post-sinaptico eccitatorio (vGlut1 e PSD-95, rispettivamente) ha acquisito da fette hippocampal di iDkk1 topi esprimenti Dkk1 per due settimane, così come i rispettivi controlli. Abbiamo analizzato queste immagini utilizzando il software Volocity ed ha dimostrato una riduzione significativa del numero di sinapsi eccitatorie, quantificato mediante la co-localizzazione dei puncta vGlut1 e PSD-95-etichettato nella regione CA1 dell'ippocampo dei topi di iDkk1 che seguono la induzione di Dkk1 per due settimane (Figura 3B, * p < 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). Nel CA1 strato radiato, il numero di sinapsi eccitatoria puncta per 1.000 µm3 è stata ridotta da 500 a topi di controllo a 300 in topi iDkk1. Al contrario, espressione di Dkk1 indotta non ha colpito il numero delle sinapsi inibitorie (identificato con la co-localizzazione tra il pre- e post-sinaptico marcatori vGAT e gephyrin, rispettivamente), come mostrato nella Figura 4A-B (p > 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo).

D'importanza, abbiamo effettuato un'analisi di potenza statistica per stimare il numero di animali necessari per generare questi risultati robusti e fette appropriato. Utilizzando R, abbiamo calcolato che sono stati necessari circa 35 fette per condizione (animali fette x 6 3 immagini x 3 = 36) per rilevare una dimensione di grande effetto (f = 0,4) con confidenza dell'80% (potenza = 0,8) in un one-way ANOVA con blocco e la replica, come descritto in passaggio 3.2.6.

Figura 3: perdita di sinapsi eccitatorie nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative dei CA1 strato radiato Visualizza sinapsi eccitatorie, identificati da co-localizzazione tra vGlut1 e PSD-95 (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) la percentuale di sinapsi eccitatorie tra controllo e iDkk1 è stata quantificata utilizzando software menzionati nella Tabella materiali (* p < 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 6 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: sinapsi inibitorie sono invariate nelle fette hippocampal da topi iDkk1. (A) immagini confocal rappresentative del CA1 strato radiato delle sinapsi inibitorie identificate tramite la co-localizzazione tra vGAT e gephyrin (frecce bianche). Il pannello inferiore rappresenta un maggiore ingrandimento del rettangolo evidenziato. Scala bar = 2 µm. (B) percentuale delle sinapsi inibitorie tra topi di controllo e iDkk1, come quantificato utilizzando il software Volocity (p > 0.05; Test di Kruskal-Wallis; 3 topi per genotipo). I dati sono rappresentati ± SEM Questa figura è stata modificata da riferimento10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione ACSF.

Tabella 2: Buffer utilizzati per la macchiatura immunofluorescente.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.