Determinazione di zona ottico della sezione trasversale del muscolo dei muscoli adulto volo indiretto di Drosophila Melanogaster

Sommario

Segnaliamo un metodo per quantificare l'area del muscolo, che è un metodo indiretto per determinare la massa muscolare in Drosophila adulti. Dimostriamo che l'applicazione della nostra metodologia analizzando il volo indiretto i muscoli in un modello di Drosophila di malattia di Steinert.

Abstract

Massa del muscolo che spreca, conosciuta come atrofia muscolare, è un fenotipo comune in Drosophila modelli di malattie neuromuscolari. Abbiamo usato i muscoli di volo indiretto (IFM) di mosche, in particolare i muscoli dorso-longitudinale (DLM), come lo sperimentale oggetto di misura il fenotipo atrofico causato da diverse cause genetiche. In questo protocollo, descriviamo come incorporare i muscoli del torace volare per il taglio sottile di semi, come ottenere un buon contrasto fra il muscolo ed il tessuto circostante e come elaborare immagini al microscopio ottico per acquisizione semiautomatica di dati quantificabili e analisi. Descriviamo tre applicazioni specifiche della pipeline metodologica. In primo luogo, ci mostra come il metodo può essere applicato per quantificare la degenerazione muscolare in un modello di distrofia myotonic fly; in secondo luogo, la misurazione della sezione trasversale del muscolo può aiutare a identificare i geni che possono promuovono o impediscono l'atrofia del muscolo e/o degenerazione del muscolo; in terzo luogo, questo protocollo può essere applicato per determinare se un candidato composto è in grado di modificare in modo significativo un determinato fenotipo atrofico indotto da una mutazione malattia-causanteo da un innesco ambientale.

Introduzione

Il torace del moscerino della frutta contiene due diverse classi di muscoli di volo, che sono funzionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distinti. Questi muscoli sono: i muscoli di volo indiretto (IFM), che sono composte di dorso-longitudinale (DLM) e muscoli del dorso-ventrale (DVM) (Figura 1) e il volo sincrono controllano muscoli^1,2. Questi muscoli generano insieme l'elevata potenza meccanica necessaria per il volo. La dimensione, la distribuzione e la disposizione rostro-caudale dell'IFMs permettono un agevole orientamento per sezionamento trasversale³ (

Protocollo

1. la fissazione e l'incorporamento di resina

1. Anestetizzare le mosche con anidride carbonica (CO₂) o tramite l'ipotermia utilizzando un blocco di ghiaccio. Utilizzare un microscopio da dissezione (con basso ingrandimento per vedere al volo tutto) e le forbici per rimuovere le gambe, Ali, testa e la parte terminale dell'addome per facilitare la penetrazione del fissativo. Un'attenta gestione delle carcasse è necessaria in questa fase per evitare la deformazione del torace.
   Nota: Iniziare con almeno 12 mosche al genotipo per assicurare un numero sufficiente di individui correttamente elaborati alla fine della procedura.
2. Trasferire le ca....

Risultati

Da quantificare se la sovraespressione di MblC o la somministrazione di Abp1 avuto alcun effetto nel fenotipo atrofico del modello fly distrofia Myotonic che ci siamo concentrati sulla DLMs, facenti parte delle IFM (Figura 1). Abbiamo determinato che il modello vola, che esprimono 250 ripetizioni CTG non codificanti in tutta la muscolatura guidato dal promotore catene pesanti della miosina (Mhc)-Gal4, ha avuto una riduzione del 50% dell'area di musco.......

Discussione

È stato dimostrato che la Drosophila melanogaster è un modello utile per studiare le malattie neuromuscolari umano^7,10,11, compreso Distrofie Miotoniche, che sono caratterizzate dalla comparsa di atrofia muscolare. Il protocollo presentato qui è un utile strumento per quantificare la degenerazione muscolare causata dall'insorgenza o la progressione di una particolare malattia in un modello fly. Ad esempio, è anche possi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Software Image-J	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotomo	Leica	Leica UC6
Microscopio	Leica	Leica MZ6	Tecnica in campo chiaro.
Lame di rasoio	Scienze della microscopia elettronica	71970	Esistono diversi fornitori alternativi.
Forbici	World Precision World	14003	Esistono diversi fornitori alternativi.
Stampi per l'inclusione Microscopia	elettronica Scienze	70900	Esistono diversi fornitori alternativi.
Glutaraldeide	Fluka (Sigma)	49624	Tossico.
OsO4	Polyscience	0972A	Estremamente tossico.
Ossido di propilene	Sigma Aldrich	82320-250ML	Estremamente tossico.
resina (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Cancerogena quando non è polimerizzata.
Toluidina blu	Panreac	251176	Tossico.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Pericoloso.
Paraformaldeide	Sigma Aldrich	P6148-500G	Nocivo.
Na2HPO4	Panreac	122507	diluizione 0,2 M.
NaH2PO4	Panreac	121677	diluizione 0,2 M.
Borace	Panreac	3052	Tossico.