Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

Summary

Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.

Abstract

L'analisi dei cambiamenti di espressione genica globale è uno strumento prezioso per identificare nuove vie sottostanti fenotipi osservati. Zebrafish è un eccellente modello per la valutazione rapida dell'intero trascrittoma da popolazioni di cellule intero animale o singoli a causa della facilità di isolamento di RNA da un gran numero di animali. Qui è presentato un protocollo per l'analisi di espressione genica globale negli embrioni di zebrafish mediante sequenziamento di RNA (RNASeq). Descriviamo la preparazione di RNA da interi embrioni o da popolazioni di cellule ottenute mediante cella ordinamento negli animali transgenici. Inoltre descriviamo un approccio per l'analisi dei dati di RNASeq per identificare percorsi arricchiti e termini di Ontology del Gene (vada) in insiemi di dati di espressione genica globale. Infine, forniamo un protocollo per la convalida dei cambiamenti di espressione genica utilizzando quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli possono essere utilizzati per l'analisi comparativa di controllo e set sperimentali di zebrafish per identificare i cambiamenti di espressione del gene novello e forniscono la comprensione molecolare nei fenotipi di interesse.

Introduction

Analisi comparativa dell'espressione genica globale sono uno strumento prezioso per identificare nuovi geni che contribuiscono ai fenotipi osservati. Tali analisi in genere si basano sulla valutazione quantitativa dell'abbondanza di trascrizione rispetto tra sperimentale e campioni di controllo. Approcci mirati, ad esempio qRT-PCR sono relativamente rapida ed accurata indagine dei cambiamenti di espressione del singolo gene. Sequenziamento di RNA (RNASeq) offre un approccio ampio, privo di ipotesi per identificare i cambiamenti significativi nell'espressione genica tra campioni, rendendo ora lo standard per tali indagini attraverso sistemi sperimentali.

Zebrafish sono emersi come un modello prominente in molte aree di malattia. Originariamente sviluppato per la loro utilità negli studi di biologia dello sviluppo, grazie alla loro alta fecondità e relativamente basso costo di manutenzione, uso sperimentale di zebrafish è evoluto per includere una vasta gamma di fenotipi da embrionali a stadi adulti pure come un vasta gamma di molecolare dosaggi^1,2,3. Infatti, questi vantaggi rendono molecolari studi meccanicistici rapido e conveniente a causa della facilità di acquisizione di grandi quantità di materiale combinato con la facilità di manipolazione sia genetica che ambientale in tutte le fasi della vita. Inoltre, la natura trasparente di zebrafish embrioni e le larve lo rendono ideale per la generazione di linee transgeniche reporter cellula - e tessuto-specifico permettendo visualizzazione in vivo di cella discreti popolazioni⁴. Lo sfruttamento di tali linee permette analisi di espressione genica globale in tipi di cellule isolate specifico basati sull'espressione del gene reporter.

Qui presentiamo un protocollo completo per l'analisi di espressione genica globale utilizzando RNASeq dopo la coltura degli embrioni di zebrafish. Manipolazioni genetiche sperimentali, tra cui morpholino (MO)-atterramento base gene transitoria o editing genomico CRISPR-mediata, sono state presentate altrove^5,6,7. Abbiamo pertanto concentrarsi su un protocollo dettagliato per l'isolamento di RNA da interi embrioni o ordinato transgenici esprimenti reporter cells seguita da semplici analisi computazionale di RNASeq risultati utilizzando strumenti di percorso e termini di gene ontology (GO). Infine, abbiamo incluso una strategia per la validazione dei cambiamenti di espressione genica di quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli sono applicabili agli embrioni di zebrafish sottoposti a una vasta gamma di condizioni sperimentali, compreso il raffronto di mutanti genetici o condizioni ambientali.

Protocol

tutti i protocolli animali descritti qui di seguito sono conformi e approvato dall'Università del Maryland istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).

1. embrione preparazione

1. generazione embrioni attraverso accoppiamento naturale
   1. embrioni di cultura a 3 mesi di età, riproduttiva maturità ^{5 , 8} .
   2. Segregare i pesci adulti di sesso maschile e femminile dal ceppo desiderato in serbatoi di accoppiamento divisi la sera prima di raccolta degli embrioni e aggiungere 2 maschi e 3 femmine per ogni cisterna.
      Nota: Uso del ceppo reporter fluorescente transgenici insulin2a:mCherry ha permesso l'analisi delle cellule β pancreatiche.
   3. Trasferimento pesci per l'accoppiamento del serbatoio con acqua fresca sistema e rimuovere il divisore immediatamente dopo le luci si accendono la mattina seguente.
   4. Consentire il pesce ad accoppiarsi naturalmente fino a quando gli embrioni sono stati osservati in fondo vasca. Raccogliere gli embrioni in intervalli di 30 min fino a quando la quantità desiderata è raccolti. Conserva ogni raccolto tempo punto di Petri separata in media di embrione al 28,5 ° C.
   5. Eseguire microinjection di materiale genetico o il collocamento in terreni di coltura sperimentale ⁶, se lo si desidera e coltura gli embrioni in fresco Hank ' s embrione medio ⁸ a 10 cm di Petri a 28,5 ° C.
      Nota: per l'analisi dell'espressione genica in morpholino (MO) iniettato o animali mutanti, si noti che ogni manipolazione può avere impatti accidentali sull'espressione genica. Mutanti possono esibire compensazione genetica a livello della trascrizione che non è osservato da MO-basata gene targeting ⁹.
2. Embrioni in fase
   1. coltura gli embrioni in gruppi di 50 – 75 embrioni a 10 cm di Petri per promuovere la tempistica dello sviluppo coerenza di tutti gli embrioni.
   2. Monitorare la morfologia dello sviluppo utilizzando microscopio da dissezione in blastomeri, epiboly e somite fasi per garantire la progressione inerente allo sviluppo ¹⁰.
      Nota: Rimuovere eventuali embrioni morente o non validi per evitare il ritardo inerente allo sviluppo nel piatto.
   3. Separare gli embrioni in base all'età dello sviluppo. Misurare l'età di embrione utilizzando somite numero dopo la segmentazione (post-gastrulazione, 10,33 h post la fecondazione (hpf)) fino a circa 24 hpf. Tappa le embrioni e le larve utilizzando la lunghezza totale del corpo dopo 24 hpf.
      Nota: I somiti sono il tessuto mesodermal a forma di chevron presente sulla parte dorsale dell'embrione.
   4. Posizionare gli embrioni ordinati in un'incubatrice di 28,5 ° C e consentire lo sviluppo di progredire verso l'età desiderata.

2. Cella singola dissociazione: Intero embrione e ordinato di popolazioni di cellule

1. dissociazione intero embrione
   1. Euthanize gli embrioni di zebrafish nella fase desiderata inserendo la capsula di Petri in ghiaccio per 5-15 minuti fino a quando non si osserva nessun movimento .
   2. Trasferire un pool di 20 embrioni una microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta. Rimuovere eventuali supporti di embrioni in eccesso dal tubo del microcentrifuge.
   3. Lisi di aggiungere 200 µ l di reagente (Vedi Tabella materiali) nella provetta contenente gli embrioni. Omogeneizzare gli embrioni nel reagente di lisi meccanicamente con un pestello. Aggiungere 800 µ l di reagente di lisi per portare il volume totale a 1 mL. Conservare a-80 ° C fino all'estrazione di RNA.
2. Isolamento delle cellule di flusso ordinato ¹¹
   1. trasferire gli embrioni da di Petri in una microcentrifuga da 1,5 mL e rimuovere quanto più medio di embrione come possibile.
      Nota: A seconda dell'età dell'embrione, dissociazione meccanica può anche essere richiesto in questa fase. Con embrioni > 48 hpf, si consiglia l'uso di un pestello di disturbare l'integrità dell'embrione prima di procedere.
   2. Incubare gli embrioni con 1 mL di tampone di dissociazione 1 (Vedi Tabella materiali) in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente. Triturare la soluzione pipettando delicatamente su e giù utilizzando una punta di P1000 per mescolare ogni 3-4 minuti durante la fase di incubazione. Centrifugare.
   3. Raccogliere gli embrioni mediante centrifugazione per 3 min a 300 x g e rimuovere il surnatante. Risospendere gli embrioni in 1 mL di tampone di dissociazione 2 (Vedi Tabella materiali). Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente con triturazione dispensare regolari.
   4. Valutare la digestione diluendo 1-2 µ l di sospensione in fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento buffer (FACS) sotto il microscopio.
      Nota: Digestione completa si è verificato quando l'aliquota esaminato Mostra singole cellule con aggregati di cellule minimal e pezzi di tessuto embrionale.
   5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min. Remove surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL FACS buffer e filtro di gravità attraverso un colino di cella di 40 µm per rimuovere il tessuto non digerito dal campione.
   6. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire con buffer di FACS per circa 1 x 10 ⁶ cellule/mL in una provetta di FACS.
      Nota: Per i tipi di cellule con un numero relativamente piccolo per embrione (meno del 5% del totale), come β-cellule pancreatiche, utilizzare un minimo di 1.000 fase-abbinato embrioni.
   7. Fornire l'impianto con i tubi di FACS contenente 1 mL di campioni così come tubo di FACS contenente solo reagente di lisi o FACS Buffer di smistamento di FACS. Cancello il flusso-sorter FACS per raccogliere solo singole cellule che esprimono il reporter fluorescente.
   8. Eseguire il FACS flusso-ordinamento fino a quando sono stati raccolti i numeri di cellulare desiderato.
      Nota: Per eseguire RNASeq, c'è un minimo richiesto di RNA totale. Abbiamo trovato che le cellule di 3.000-5.000 sono sufficienti per isolare RNA di alta qualità, ad alta concentrazione.
   9. Conservare le cellule prelevate sul ghiaccio e procedere immediatamente alla preparazione di RNA.

3. Preparazione di RNA

1. Estrarre RNA
   1. Incubare il campione prelevato (dal passaggio 2) con reagente di lisi per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Aggiungi 0,2 mL di cloroformio per ogni 1,0 mL di reagente di lisi utilizzato ed invertire i tubi a mano per 15 s. Incubare per 2-3 min a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
   3. Trasferire la fase acquosa, separata in una nuova provetta e aggiungere 0,5 mL di isopropanolo per ogni 1,0 mL di reagente di lisi utilizzato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
   4. Lavaggio con etanolo al 75% e centrifugare i campioni a 7.500 x g per 5 min a 4 ° C. eliminare il surnatante completamente e asciugare all'aria a temperatura ambiente. Risospendere il RNA in 15-30 µ l dietil pirocarbonato (DEPC)-acqua trattata.
2. Purificare alta qualità RNA
   1. combinare la sospensione di RNA con acetato di 1/10 di volume 3M sodio (pH 5,5) e 1 volume di isopropanolo. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e centrifugare i campioni a 12.500 x g per 10 min a 4 ° C.
   2. Lavare il pellet con etanolo 70% ghiacciata in acqua trattata con DEPC e centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
   3. Rimuovere il supernatante e lasciare per asciugare a temperatura ambiente. Risospendere in acqua trattata con DEPC.
   4. Analisi il RNA estratto per la concentrazione (ng / µ l) e la purezza (rapporto di 260/230) utilizzando uno spettrometro di assorbimento. Assicurarsi che il valore di 260/230 ~ 2.0 prima di procedere con RNASeq. Conservare a-80 ° C fino a noie (fino a 6 mesi).
   5. Inviare i campioni di RNA a un fornitore o un nucleo per RNASeq e modificare l'espressione genica analisi basata sulla quantificazione del sequenziamento letture. I risultati restituiti dal fornitore sono in genere forniti come una lista di geni che esibiscono un cambiamento significativo di piega in trascrizione letture tra campioni.
      Nota: Una colonna può essere utilizzata se il metodo sopra descritto produce RNA di scarsa qualità. La quantità, la concentrazione e il numero di integrità di RNA (RIN) per campioni di RNA dovrebbe essere confermate con il fornitore o il nucleo. Il fornitore o il nucleo valuterà anche in genere RIN.

4. GO termine analisi e percorso

Nota: vedere la Figura 1 di uscita rappresentativo, l'analisi di espressione genica dopo RNASeq forniti dal fornitore o core.

1. Ordinamento differenzialmente espressi geni
   1. confrontando una sola condizione sperimentale contro controllo
      1. Open dati (risultati) in un software di gestione di fogli di calcolo (Vedi tabella materiali ).
      2. Selezionare la freccia a discesa accanto alla ' specie ' pulsante e selezionare " ordinamento personalizzato " all'interno del foglio di calcolo contenente i geni differenzialmente espressi in sperimentale contro la condizione di controllo.
      3. Selezionare la casella in ' colonna ' nella finestra che si apre e scegliere di ordinare per la ' LFC ' colonna. Garantire ' valori ' è selezionata nella ' sorta su ' colonna. Selezionare questa opzione per ordinare da ' più grande al più piccolo ' alla ' ordine ' colonna e fare clic su " OK ".
         Nota: Questo ordinerà i geni differenzialmente espressi in modo che quelli con l'espressione aumentata (positivo LFC) apparirà nella parte superiore dell'elenco, mentre quelli con ridotta espressione (negativo LFC) apparirà nella parte inferiore dell'elenco.
   2. Confrontare le condizioni sperimentali multipli per un singolo controllo come segue.
      1. Selezionare la prima cella in una colonna vuota sul 1 sperimentale rispetto al foglio di calcolo di controllo per determinare differenzialmente espressi geni trovati in due condizioni sperimentali. Digitare la seguente formula nella cella:
         
         Nota: questa equazione è una combinazione di IF, ISERROR e funzioni MATCH. (i) la funzione MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), andrà a cercare il valore nella cella A1 (l'ID di ENSEMBL) nella colonna (A:A) del foglio di calcolo denominato Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Il " 0 " indica per cercare una corrispondenza esatta, e se viene trovata una corrispondenza esatta, la funzione restituirà un valore di " 1 ", mentre se viene trovata alcuna corrispondenza, la funzione restituirà un errore " N/A ". (ii) il risultato della funzione MATCH viene quindi immesso nella funzione ISERROR, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), dove, se l'input è " 1 " è stato trovato che indica una corrispondenza, verrà restituito " FALSE ", e se l'input è " N/A " che indica una corrispondenza non trovata, verrà restituito " vero ". (iii) i " vero " o " FALSE " risultato è quindi input nella funzione se, se (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " duplicare "), dove, se l'input è " vero " che indica una corrispondenza non trovata, verrà restituito il valore tra il primo set di virgolette (" ") che è vuota, e quindi la cella sarà vuota. Se l'input è " FALSE " che indica una corrispondenza è stata trovata, verrà restituito il valore tra il secondo set di virgolette (" duplicare "), e la cella dirà " duplicare ".
      2. Press " invio " o " restituire " per eseguire l'equazione. Selezionare la cella contenente l'equazione e fare clic sulla casella nell'angolo inferiore destro della cella. Tenere il mouse cliccato e trascinare l'area selezionata tutto il senso giù la colonna fino all'ultima ' ID funzionalità ', copiare l'equazione in ogni cella nella colonna.
      3. Selezionare " ordinamento personalizzato " ancora, aggiungere un secondo livello di ordinamento cliccando il " + " sull'icona nell'angolo inferiore sinistro. Nel primo livello, " Ordina ", in selezionare colonna " duplicare ", in genere su selezionare ' valori ' e in selezionare ordine ' dalla Z alla A '. Nel secondo livello, " poi di ", in selezionare colonna ' LFC ', in genere su selezionare ' valori ' e in selezionare ordine ' più grande al più piccolo ' e selezionare " OK ".
         Nota: Questo ordinerà l'elenco dei geni in 4 gruppi basati sopra direzionalità del cambiamento di espressione. È importante controllare i geni trovati in entrambe le condizioni sperimentali per garantire che il cambiamento nell'espressione è nella stessa direzione in entrambi o in direzioni opposte.
      4. Rimuovere qualsiasi parentesi dalla colonna di simboli di gene, prima di procedere o i risultati non verranno trovati nei database. Selezionare l'intera colonna contenente simboli di gene. Selezionare " modificare " quindi " sostituire " a discesa ' File ' menu. Tipo " (*) " alla " trovare cosa: " barra della finestra Sostituisci e lasciare il " sostituire con: " bar vuoto. Selezionare ' Sostituisci tutto ' per rimuovere tutte le istanze di parentesi.
         Nota: Il * rappresenta un numero qualsiasi di caratteri, inserendo questo personaggio tra due parentesi, il programma viene richiesto di trovare qualsiasi istanza in celle evidenziate e qualsiasi istanza di parentesi verrà sostituito con niente, quindi rimuoverli.
2. Determinazione arricchita vie
   1. copia i simboli di gene dell'insieme per cui si desidera determinare le vie arricchite negli Appunti. Andare a ConsensusPathDB ¹². Selezionare " Gene impostata analisi " nella sidebar di sinistra della pagina Web, seguita da " analisi di sovrarappresentazione ".
   2. Incollare l'elenco dei geni nella " incollare un elenco di identificatori di proteina/del gene " casella. Sigla del gene seleziona nel " tipo di identificatore di proteina/del Gene " e fare clic su " procedere ". Selezionare la casella accanto a " vie come definito dal database via " sotto il Pathway-based imposta sezione.
      Nota: Un numero di opzioni per l'analisi verrà visualizzato compreso l'elenco dei database disponibili per ricerca. Si consiglia di-selezionare tutti i database ad eccezione del database di Kegg e Reactome come sono i più affermati e completa. La sovrapposizione minima con impostazioni di taglio input elenco e p-valore può essere regolata anche sulla base delle esigenze. Si consiglia di lasciare queste impostazioni presso la sovrapposizione minima di 2 gene predefinito e un cut-off valore 0,01 p.
   3. Selezionare " trovare arricchito set " per ottenere l'elenco delle vie contenenti geni nell'elenco degli input.
      Nota: L'uscita sarà in formato tabella, incluso il nome di ciascun percorso seguito da " impostare dimensione " (che indica il numero di geni totale nella via), " candidati contenuti " (che indica il numero di geni nell'elenco di input che sono in quella via ), così come il valore di p e q-valore (FDR) e il database da cui è stato identificato il pathway.
3. Generazione di via reti
   1. determinare percorsi arricchiti come descritto sopra.
   2. Selezionare tutte le vie arricchite da visualizzare in una rete via selezionando ogni casella accanto ai nomi di percorso da visualizzare oppure facendo " tutti i " sotto " selezionare " nell'intestazione di colonna sopra le caselle di selezione, quindi selezionare " Visualizzare set selezionati ".
      Nota: Si consiglia di visualizzare tutti i percorsi, se ci sono meno di 30; Se ci sono superiori a 30 vie si consiglia di scegliere le vie più arricchite 30 top (quelli che contengono il maggior numero di geni da elenco di input).
   3. Regolare la " sovrapposizione relativo " e " ha condiviso i candidati " filtri, selezionando delle caselle in alto al centro della pagina e l'immissione di desirper cento ed relativo si sovrapporre o si sovrappone a numero di candidati condivisi, per essere più severe al fine di rendere il più pertinente nell'ambito delle reti di percorso più chiare e selezionare " applicare ".
      Nota: Si consiglia una sovrapposizione minima relativa di 0.2, che indica una sovrapposizione genica 20% tra 2 vie per collegarli e un minimo di 2 candidati condivisi. La legenda del grafico può essere visto cliccando sulla legenda grafico in alto a sinistra della pagina.
4. Determinazione di arricchito va termini
   1. copiare i simboli del gene del gruppo per il quale si vuole determinare le ontologie arricchito genica negli Appunti. Vai al ' strumento di analisi di arricchimento GO ' del Consorzio di Ontology del Gene ¹³. Incollare l'elenco dei simboli del gene nella casella sul lato sinistro della pagina sotto " il gene IDs qui … "
   2. selezionare il set di termini GO da utilizzare, elencati sotto la casella di IDs gene: processo biologico, funzione molecolare o componente cellulare. Scegliere (consigliato) ' processo biologico '. Selezionare ' Danio rerio ' sotto il GO termini casella e fare clic " invia ".
      Nota: Si consiglia di utilizzare il cutoff di p-valore predefinito pari a 0,05.

5. Verifica mediante qRT-PCR

Nota: singoli geni identificati con cambiamenti di espressione genica significativo in RNASeq devono essere verificati mediante qRT-PCR mirati a replicati esperimenti.

1. sintesi del cDNA
   1. estrarre il RNA da embrioni usando il metodo descritto nella sezione 3.1. Estrazione del RNA.
   2. Convertire 1 µ g di RNA in cDNA mediante cDNA conversione kit (Vedi Tabella materiali). Combinare RNA, dNTPs ed enzima trascrittasi inversa. Eseguire la reazione di termociclatore secondo il produttore ' specifiche s.
   3. Diluire 1:3 di cDNA in acqua trattata con DEPC. Conservare a 4 ° C fino a 1-2 mesi.
2. Verifica qRT-PCR
   1. selezionare geni per verificare mediante qRT-PCR dai risultati del sequenziamento di RNA. Identificare i geni con piega alta cambiamenti nell'espressione. Determinare quale di questi geni contengono anche alta lettura conta, come questo indica espressione abbondante.
   2. Selezionare 10-12 bersagli dalla variazione piega alta, elenco di alto conteggio lettura dei geni. Disegnare primers per amplificare i geni bersaglio che abbracciano almeno 1 introne-esone limite.
   3. Inserire il gene o la regione di destinazione del gene in qPCR primer design sito ¹⁴. Selezionare il " 2 qPCR primer di design " e richiedere il sito per creare set di primer.
      Nota: Assicurarsi di includere il primer di controllo interno, come β-actina, per normalizzare i confronti tra i campioni. I primers di β-actina sono 5 f: ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' e r: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '.
   4. Combinare il cDNA, forward primer, primer inversa e polimerasi. Eseguire l'amplificazione di qRT-PCR per determinare l'espressione relativa dei geni ¹⁵.
   5. Analizzare l'espressione relativa di mRNA di geni di interesse di quantificazione relativa determinazione ¹⁵.
   6. Confrontare il qRT-PCR RNASeq risultati per assicurarsi che la direzionalità dell'espressione differenziale è coerenza di.

Results

L'ordinamento di differenzialmente espressi geni:

Per identificare geni differenzialmente espressi nella fase larvale di zebrafish modelli di sindrome di Alström e sindrome di Bardet-Biedl (BBS), siamo presi di mira sia alms1 o trascrizioni di bbs1 iniettando convalidato in precedenza della giuntura-blocco MOs in selvaggio-tipo zebrafish embrioni^16,17. 5 g...

Discussion

L'approccio descritto in questo protocollo offre una strategia relativamente rapida ed economica per livello transcriptome analisi di animali interi o popolazioni di specifiche cellule ordinato. Zebrafish fornisce un modello vantaggioso per questo tipo di studio per la facilità e la rapidità nel generare grandi quantità di avvio materiale, la facilità di implementazione genetico o ambientale condizioni sperimentali e la disponibilità di un grande spettro delle linee transgeniche reporter consentendo per isolamento di tip...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti commerciali
TriZol	Thermo Scientific	Reagente per lisi	15596026
TrypLE	Gibco	12604013	tampone di dissociazione 1
FACSMax	Genlantis	T200100	tampone di dissociazione 2
acqua trattata con DEPC	Sigma	95284
Kit	conversione cDNA	FirstStrand Thermo Scientific	K1621
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
tampone FACS Fisher	Scientific	50-105-9042
cloroformio	Sigma Aldrich	288306
acetato di sodio	Sigma Aldrich	S2889
strong> Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	< strong>Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
40 micron filtro cellulare	Sigma	CLS431750
tubo FACS	Emocitometro 352063
	Falcon Sigma	Z359629
Microscopio da dissezione	Zeiss
Microscopio invertito	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Serbatoi di accoppiamento 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
tubo FACS 5 mL tubo rigido in polipropilene	BD Falcon	352063
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Software
Excel	Microsoft
Consensus Path DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Analisi dell'arricchimento	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis