Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

Timothy L. Hostelley; Jessica E. Nesmith; Norann A. Zaghloul

doi:10.3791/56187

Method Article

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

DOI:

10.3791/56187

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October 27th, 2017

Timothy L. Hostelley*¹ , Jessica E. Nesmith*¹ , Norann A. Zaghloul¹

¹Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

Summary

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Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.

Abstract

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L'analisi dei cambiamenti di espressione genica globale è uno strumento prezioso per identificare nuove vie sottostanti fenotipi osservati. Zebrafish è un eccellente modello per la valutazione rapida dell'intero trascrittoma da popolazioni di cellule intero animale o singoli a causa della facilità di isolamento di RNA da un gran numero di animali. Qui è presentato un protocollo per l'analisi di espressione genica globale negli embrioni di zebrafish mediante sequenziamento di RNA (RNASeq). Descriviamo la preparazione di RNA da interi embrioni o da popolazioni di cellule ottenute mediante cella ordinamento negli animali transgenici. Inoltre descriviamo un approccio per l'analisi dei dati di RNASeq per identificare percorsi arricchiti e termini di Ontology del Gene (vada) in insiemi di dati di espressione genica globale. Infine, forniamo un protocollo per la convalida dei cambiamenti di espressione genica utilizzando quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli possono essere utilizzati per l'analisi comparativa di controllo e set sperimentali di zebrafish per identificare i cambiamenti di espressione del gene novello e forniscono la comprensione molecolare nei fenotipi di interesse.

Introduction

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Analisi comparativa dell'espressione genica globale sono uno strumento prezioso per identificare nuovi geni che contribuiscono ai fenotipi osservati. Tali analisi in genere si basano sulla valutazione quantitativa dell'abbondanza di trascrizione rispetto tra sperimentale e campioni di controllo. Approcci mirati, ad esempio qRT-PCR sono relativamente rapida ed accurata indagine dei cambiamenti di espressione del singolo gene. Sequenziamento di RNA (RNASeq) offre un approccio ampio, privo di ipotesi per identificare i cambiamenti significativi nell'espressione genica tra campioni, rendendo ora lo standard per tali indagini attraverso sistemi sperimentali.

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Protocol

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tutti i protocolli animali descritti qui di seguito sono conformi e approvato dall'Università del Maryland istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).

1. embrione preparazione

generazione embrioni attraverso accoppiamento naturale
1. embrioni di cultura a 3 mesi di età, riproduttiva maturità ⁵ ^, ⁸.
2. Segregare i pesci adulti di sesso maschile e femminile dal ceppo desiderato in serbatoi di accoppiamento divisi la sera prima di raccolta degli embrioni e aggiungere 2 maschi e 3 femmine per ogni cisterna.
  Nota: Uso del ceppo ....

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Results

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L'ordinamento di differenzialmente espressi geni:

Per identificare geni differenzialmente espressi nella fase larvale di zebrafish modelli di sindrome di Alström e sindrome di Bardet-Biedl (BBS), siamo presi di mira sia alms1 o trascrizioni di bbs1 iniettando convalidato in precedenza della giuntura-blocco MOs in selvaggio-tipo zebrafish embrioni¹⁶^,¹⁷. 5 g.......

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Discussion

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L'approccio descritto in questo protocollo offre una strategia relativamente rapida ed economica per livello transcriptome analisi di animali interi o popolazioni di specifiche cellule ordinato. Zebrafish fornisce un modello vantaggioso per questo tipo di studio per la facilità e la rapidità nel generare grandi quantità di avvio materiale, la facilità di implementazione genetico o ambientale condizioni sperimentali e la disponibilità di un grande spettro delle linee transgeniche reporter consentendo per isolamento di tip.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti commerciali
TriZol	Thermo Scientific	Reagente per lisi	15596026
TrypLE	Gibco	12604013	tampone di dissociazione 1
FACSMax	Genlantis	T200100	tampone di dissociazione 2
acqua trattata con DEPC	Sigma	95284
Kit	conversione cDNA	FirstStrand Thermo Scientific	K1621
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
tampone FACS Fisher	Scientific	50-105-9042
cloroformio	Sigma Aldrich	288306
acetato di sodio	Sigma Aldrich	S2889
strong> Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Zebrafish Strains
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	< strong>Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
40 micron filtro cellulare	Sigma	CLS431750
tubo FACS	Emocitometro 352063
	Falcon Sigma	Z359629
Microscopio da dissezione	Zeiss
Microscopio invertito	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Serbatoi di accoppiamento 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
tubo FACS 5 mL tubo rigido in polipropilene	BD Falcon	352063
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Software
Excel	Microsoft
Consensus Path DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Analisi dell'arricchimento	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

di <BD

References

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Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

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Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

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Protocol

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