Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.
Articolo metodologico
Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane
In questo articolo
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Sommario
Abstract
All'interno del sistema immunitario innato, linfociti effettori conosciuti come cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo essenziale nella difesa dell'ospite contro le cellule aberranti, in particolare eliminando tumorali e cellule infette viralmente. Circa 30 difetti noti monogenici, insieme a una serie di altre condizioni patologiche, causano la mancanza delle cellule NK sia funzionale o classica, che si manifesta ridotta o assente attività citotossica. Storicamente, la citotossicità è stata studiata con metodi radioattivi, che sono ingombranti, costosi e potenzialmente pericolose. Questo articolo viene descritto un metodo di base di cytometry di flusso aerodinamico, clinicamente applicabile per quantificare l'attività citotossica delle cellule NK. In questo saggio, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o preparazioni purificate di cellule NK sono co-incubate a diversi rapporti con una linea cellulare di tumore destinazione conosciuta ad essere sensibili alla citotossicità cellulo-mediata NK (NKCC). Le cellule bersaglio sono pre-etichettate con un colorante fluorescente per permettere la loro distinzione dalle cellule effettrici (cellule NK). Dopo il periodo di incubazione, le cellule bersaglio uccisi sono identificate da una macchia di acido nucleico, che permea in modo specifico le cellule morte. Questo metodo è favorevole alla sia diagnostico e applicazioni di ricerca e, grazie alle funzionalità multi-parametro di citometria a flusso, presenta il vantaggio aggiunto di potenzialmente consentire un'analisi più approfondita del fenotipo delle cellule NK e funzione.
Introduzione
Cellule natural killer (NK) sono un sottoinsieme sofisticato dei linfociti umani innati criticamente coinvolti nell'eliminazione delle cellule infettate viralmente, cellule trasformate e altri patogeni minacce 1,2. Granuli litici delle cellule di NK casa proteine citotossiche, come perforine e granzimi. Al momento dell'attivazione, le cellule NK formano una complessa interazione con i loro obiettivi conosciuto come sinapsi immunologica, per cui queste molecole citolitiche localmente vengono rilasciate, con conseguente lisi delle cellule bersaglio diretto e apoptosi, insieme al rilascio di citochine e chemochin....
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Protocollo
I campioni sono stati raccolti secondo le linee guida etiche stabilite dal Programma di Protezione della Ricerca Umana dell'UCLA e approvati dall'IRB.
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Se non diversamente specificato, tutti i reagenti devono essere lasciati equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso. Tutti i reagenti devono rimanere sterili.
- Preparare una soluzione di lavoro 2x di Tween-20 (cioè 0,2%) aggiungendo 10 μL di soluzione Tween-20 a 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio con una pipetta p20.
- Data l'elevata viscosità di Tween-20, adott....
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Risultati
Prima di impostare il dosaggio, si consiglia vivamente che contenuto delle cellule NK essere valutata nella popolazione dell'effettore di scelta. La figura 1 Mostra una tipica colorazione CD56 prima (luce blu) e dopo arricchimento di cellule NK (rosso). Le cellule NK comprendono fino a 15% di PBMCs e devono essere almeno 80% puro dopo arricchimento.
Analisi cytometric di flusso in questo test compor.......
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Discussione
Il metodo qui descritto fornisce un'alternativa semplice e conveniente per il test di rilascio di Cr tradizionale 51per valutare l'attività citotossica delle cellule NK. Questo metodo è sensibile, riproducibile e richiede meno tempo rispetto ai metodi standard precedenti, come CRA e può essere usato per entrambi clinici e applicazioni di ricerca.
Mentre il dosaggio funziona sia con totale PBMCs e arricchito le cellule NK, l'opzione per utilizzare PBMCs senza la necessità di purifica.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse finanziario.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, per la sua assistenza con la preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (1x, senza Ca2+ e Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Siero fetale bovino inattivato termicamente | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillina Streptomicina | Life Technologies | 15140-163 | Soluzione madre a 10.000 U/mL |
| IL-2 | R& D Systems | 202-IL-050 | Liofilizzato da 0,2 μ m soluzione filtrata in acetonitrile e TFA con BSA come proteina trasportatrice. Ricostituire con 500 ul a 100 μ g/mL in acido acetico sterile 100 mM contenente almeno lo 0,1% di albumina sierica bovina (2,1x10E6 UI/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Linea cellulare tumorale |
| Fiasche per colture cellulari T-75 | Kit di proliferazione cellulare Corning | 431464 | |
| CFSE | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Ricostituire la fiala I con 18 ul di DMSO per preparare una soluzione madre da 5 mM. Non congelare/scongelare. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | La soluzione stock è fornita a 5 μ M in 1 mL DMSO. La soluzione DMSO può essere sottoposta a più cicli di congelamento-scongelamento senza degradazione del reagente. |
| Provette per prelievo di sangue con eparina di sodio/litio | BD | 02-687-95 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | CLS3897 | |
| Pipette sierologiche | BD Falcon | ||
| Provette in polistirene a fondo tondo (5 ml) | BD Falcon | 14959-5 | |
| Provetta conica in polipropilene da 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| 15 ml tubo conico in polipropilene | BD Falcon | 352097 | |
| Serbatoio di reagenti | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Cocktail di arricchimento di cellule NK umane | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Riferimenti
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
