Articolo metodologico

Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

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DOI:

10.3791/56212

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22 agosto 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo per misurare direttamente il RNA di trasferimento carica livelli da purificato Escherichia coli RNA così come un modo per confrontare i livelli relativi di RNA di trasferimento, o qualsiasi altri RNA breve, attraverso diversi campioni basati sull'aggiunta di spike-a cellule che esprimono un gene di riferimento.

Abstract

RNA transfer (tRNA) è una parte essenziale dell'apparato traduzionale in qualsiasi organismo. tRNAs legano e trasferire gli aminoacidi al ribosoma traduzione. I livelli relativi di tRNAs differenti ed il rapporto di aminoacylated tRNA per tRNA totale, conosciuto come il livello di carico, sono fattori importanti nel determinare l'accuratezza e la velocità di traduzione. Di conseguenza, l'abbondanza e livelli di carica di tRNAs sono variabili importanti per misurare quando si studia la sintesi delle proteine, ad esempio in varie condizioni di stress. Qui, descriviamo un metodo per la raccolta del tRNA e misurando direttamente l'abbondanza relativa e il livello di carico assoluto di determinate specie di tRNA in Escherichia coli. Il tRNA è raccolto in modo tale che il legame labile tra il tRNA e l'aminoacido è conservato. il RNA è quindi sottoposto a elettroforesi su gel e Northern blotting, che si traduce nella separazione dei tRNAs cariche e scariche. I livelli di specifici tRNAs nei diversi campioni possono essere paragonati a causa dell'aggiunta di spike-a celle per la normalizzazione. Prima Purificazione RNA, aggiungiamo 5% delle cellule di Escherichia coli che overproduce la rara di tRNAselC a ciascun campione. La quantità di specie di interesse in un campione di tRNA è poi normalizzata alla quantità di tRNAselC nello stesso campione. Aggiunta di spike-in cellule prima Purificazione RNA ha il vantaggio rispetto alla aggiunta di purificato RNA spike-in che è anche responsabile di eventuali differenze di efficienza di lisi delle cellule fra i campioni.

Introduzione

Di seguito, presentiamo un metodo per quantificare specifico tRNAs e misurare la loro carica livelli mediante Northern blotting. Il metodo si basa su una tecnica sviluppata da Varshney et al. 1. raccolta delle cellule in acido tricloroacetico (TCA) e mantenere i campioni a 0 ° C durante la purificazione di RNA, il legame estere tra il tRNA e l'aminoacido è conservata2,3,4. Aminoacylated tRNAs si distinguono dalle loro controparti nonacylated gel elettroforesi e macchiare nordico, dovuto ad una mobilità in diminuzione del aminoacylated tRNA nel gel, causato dalla covalentemente aminoacido5. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la normalizzazione della quantità di tRNA con aggiunta di spike-in cellule che overexpressing il raramente usato tRNAselC 4.

tRNAs sono alcune delle molecole più abbondanti nella cellula batterica e una parte vitale dell'apparato di traduzione. tRNAs legano gli amminoacidi e trasferirli i ribosomi traduzioni. L'associazione di aminoacidi per tRNAs (aminoacylation o ricarica) è facilitato dalla sintetasi del tRNA di aminoacyl. L'abbondanza relativa di diversi tRNAs carica è importante per assicurare la fedeltà della sintesi proteica, poiché sottorappresentanza delle cognate carica che tRNA per un codone determinato RNA messaggero (mRNA) aumenta la probabilità che un tRNA vicino cognate sarà erroneamente consegnare suo aminoacido a catena del polipeptide crescente sul ribosoma6. L'importanza della carica tRNA si riflette nella vasta risposta della cella e. coli a un drastico calo dei livelli di carica di un tRNA; la risposta rigorosa. Durante la risposta rigorosa la sintesi di tRNA, RNA ribosomiale (rRNA) e maggior parte dei mRNAs è abbassata a favore di trascrizione di mRNA specifici connessi con la sopravvivenza dell'amminoacido biosintesi e stress, e il tasso di crescita delle cellule è abbassato drasticamente7 . Inoltre, il recente lavoro da noi e gli altri ha mostrato che e. coli degrada attivamente la maggior parte dei suoi tRNA in risposta alle sollecitazioni che limitano traduzione4,8, suggerendo che la regolazione dei livelli di tRNA può essere importante per far fronte a tali sollecitazioni. Così, misurazioni affidabili delle abbondanze di tRNA e livelli di ricarica sarà uno strumento importante per comprendere pienamente le risposte batteriche di sforzo.

E. coli è comunemente usato per esprimere la proteina ricombinante e a causa delle differenze nell'uso di codone tra specie, espressione non ottimale è un problema spesso affrontato9. Questo può essere aggirato da espressione di tRNAs aggiuntive necessarie per tradurre il mRNA ricombinante10. Misurazioni di tRNA livelli in tali ceppi di ricarica potrebbero guidare gli sforzi sulla risoluzione dei problemi e ottimizzare l'espressione della proteina.

Questo metodo consente anche la rilevazione di "orifizio"; una molecola di tRNA aminoacylated con un aminoacido non-affine. Aminoacylation di aminoacidi diversi può causare un tRNA per la migrazione con velocità leggermente diverse attraverso i gel di poliacrilammide1,11. In alcuni casi, il metodo utilizzabile anche per distinguere diversi modifica modelli altrimenti identici tRNAs3.

Un altro istituita procedura biochimica per l'indagine di tRNA livelli di carica è periodato ossidazione. Il metodo si basa sull'osservazione che periodato aminoacylated tRNA è protetto dall'ossidazione e uncharged tRNA non è. Periodato dopo trattamento di ossidazione della ricarica del tRNA viene utilizzata per stimare i livelli di carica del RNA raccolto. Tuttavia, la ricarica dei diversi tRNAs ha dimostrata di essere colpiti dal trattamento fornendo così qualche inesattezza12. Il metodo qui presentato misure carico direttamente da RNA purificato, escludendo quindi eventuali pregiudizi da reazioni chimiche o enzimatiche. Una limitazione di questo metodo è che solo una specie di tRNA viene rilevato in un momento, così anche se la stessa Northern blot può essere spogliato e reprobed per più tRNAs, è che richiede tempo e un po ' laborioso per raccogliere dati su molti tRNAs.

Un modo affidabile di normalizzazione dei campioni a vicenda è fondamentale negli studi dove l'obiettivo è quello di confrontare i livelli relativi di una molecola attraverso diversi campioni. Qui introduciamo una procedura di normalizzazione per RNA dove una piccola aliquota di Escherichia coli cellule che overexpressing il tRNA raraselC è aggiunto come spike-in per tutti i campioni sperimentali prima Purificazione RNA. Questo metodo è utile non solo quando si esaminano i tRNAs ma per quantificazione relativa di ogni specie di RNA quando la messa a punto sperimentale è tale che nessun RNA endogeno può essere attendibile per essere presenti alla stessa concentrazione cellulare in tutti i campioni. Ad esempio, il livello di una "pulizia" RNA ribosomiale RNA-come spesso viene utilizzato come un riferimento endogeno per confrontare le relative quantità di RNA un altro tra i diversi campioni13. Ma questo è di scarsa utilità se la concentrazione cellulare del RNA riferimento varia tra i campioni, come può essere il caso per il RNA ribosomiale (rRNA) se il campionamento avviene durante un sforzo risposta15,16,17 o durante entrata in fase stazionaria17. L'aggiunta di spike-in cellule di campioni sperimentali prima Purificazione RNA fornisce un modo solido e preciso di normalizzazione indipendenti del setup di campionamento. Un altro modo di standardizzazione è l'aggiunta di uno o più RNA di spike ai campioni sperimentali dopo la purificazione di RNA. Tuttavia, questo metodo non tiene conto delle eventuali differenze di recupero di RNA tra campioni.

Utilizzando cellule di Escherichia coli che iperesprimere il riferimento RNA come spike-in celle (Vedi Figura 1) in un esperimento su Escherichia coli ha lo svantaggio che risulta inoltre di una piccola quantità di esogeno Escherichia coli totale RNA per la campioni. Correggiamo per questa aggiunta analizzando un campione contenente solo spike-in celle in parallelo con i campioni sperimentali (Vedi il Northern blot nel Figura 2, lane etichettato "selC"). Il protocollo presentato è stato sviluppato per e. coli K-12 ma è probabile che sia applicabile per la maggior parte delle specie batterica.

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Protocollo

1. preparazione delle colture batteriche.

  1. Crescere tutte le culture in matracci di Erlenmeyer con un rapporto di volume matraccio di cultura al massimo 1/6. In una tipica configurazione sperimentale, crescono le culture a 37,0 ° C e scuotendo a 160 giri/min in morpholinepropanesulfonic acido (MOPS) minimo medio 18 completati con la fonte di carbonio preferito, ad esempio 0,2% glucosio, per almeno 10 generazioni successive prima raccolta RNA.
  2. Il giorno prima della raccolta del RNA, diluire una cultura sovrasviluppata del ceppo desiderato in MOPS medium minimo in modo che raggiungerà la desiderata OD 436 al momento desiderato il giorno seguente. Calcolare il volume di cultura sovrasviluppata da usare per l'inoculazione con la formula:
    figure-protocol-1
    Nota: qui, OD nuovo denota la desiderata OD 436 dopo l'incubazione, V nuovo denota il volume della cultura diluito, OD vecchio denota la OD 436 della cultura sovrasviluppata diluito da, G indica il numero di generazioni la cultura crescerà, dalla tempo di diluizione (t 1) il tempo è necessario il giorno dopo (t 2) e può essere calcolata come: tempo di differenza (in minuti) tra t 1 e t 2 diviso per il tempo di generazione (in min). Per garantire la crescita allo steady-state al momento del campionamento, G dovrebbe essere ≥ 10; V vecchio denota il volume della cultura fuori-coltivato che dovrebbe essere trasferito al medium fresco. Questa equazione è un'approssimazione che non tiene conto per qualsiasi fase di ritardo; un fenomeno spesso osservato dopo diluizione di una cultura fuori-coltivata nei mezzi freschi.
    1. Condizioni di crescita variano a seconda dello scopo dell'esperimento, ma per limitare cellula--cellula variazione nei livelli di tRNA e per incrementare la riproducibilità dei risultati, (consigliato) crescono le culture di stato prima del campionamento stazionario 19.

2. Preparazione delle cellule di spike

Nota: il ceppo di e. coli MAS1074, che esprime il gene selC codifica tRNA selC sotto il controllo di un isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promotore inducibile è utilizzato come il ceppo di spike-a.

  1. Diluire una cultura sovrasviluppata di MAS1074 a un OD 436 di 0.05 in MOPS minimal supplementato con 100 µ g/mL ampicillina e 0,2% di glucosio. Far crescere la cultura a 37 ° C in agitazione a 160 giri/min.
    Nota: Vedere la discussione per l'uso di un ceppo di riferimento alternativi.
  2. OD a 436 ~ 0.1, aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione di tRNA selC. Far crescere la cultura a OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h di crescita) e spostare il matraccio di cultura in un bagno di ghiaccio. Mantenere la cultura di spike-in cella su ghiaccio fino a quando tutti i campioni per la purificazione di RNA sono state raccolte.

3. Raccolta di campioni sperimentali.

  1. Pre-calda (37 ° C), uno capped beuta da 100 mL (o simili) contenente 4 mL 10% (p/v) l'acido tricloroacetico (TCA) per ogni campione collocandolo in un bagno di acqua riscaldata.
    Nota: attenzione, TCA si decompone al riscaldamento, producendo fumi tossici e corrosivi, compreso acido cloridrico e cloroformio. La soluzione in acqua è un acido forte; reagisce violentemente con basi ed è corrosivo per molti metalli. Corretta precauzione dovrebbe essere presa quando usando questo liquido.
  2. Immediatamente prima della raccolta delle cellule, misurare e registrare la OD 436 della cultura.
  3. Per raccogliere le cellule, trasferire 4 mL di coltura in un pallone pre-riscaldato contenente TCA.
  4. Mescolare il campione agitando a mano il matraccio per 5 s. miscelazione con TCA immediatamente Disattiva attività enzimatiche tutte e quindi conserva i livelli di carica dei tRNAs.
    Nota: Se più campioni devono essere raccolti, di mantenere campioni raccolti in TCA su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti.

4. Aggiunta di spike-a cellule

Nota: preparazione delle cellule di spike è descritta nel passaggio 2.

  1. Quando tutti i campioni per la preparazione di RNA sono stati raccolti, aggiungere 5% spike-in celle (basate su OD) di ciascun campione.
    Nota: Il volume di picco-in cella cultura necessaria è calcolato con la formula:
    figure-protocol-2
    dove V picco indica il volume di picco-in cella cultura necessaria, V Exp indica il volume di coltura raccolto cellulare sperimentale (senza TCA), OD exp denota la OD 436 della cultura sperimentale delle cellule al momento della vendemmia in TCA. OD a spillo denota la OD 436 della cultura spike-in cella. Se campioni multipli vengono raccolte a diversi ODs, il volume delle cellule di spike aggiunto deve essere regolato secondo la formula di cui sopra per ciascun campione.
  2. Quantificare il contributo dalle cellule spike-in per le specie di RNA di interesse, preparare un campione contenente solo spike-in celle da 4 mL di miscelazione spike-in celle con 4 mL TCA. Preparare il RNA da questo campione nello stesso modo per quanto riguarda gli altri campioni.
  3. Facoltativamente, prendere un altro matraccio contenente solo il campione sperimentale, senza spike-nelle cellule e includerlo per quantificare il contributo del campione sperimentale per il tRNA selC livelli; i livelli endogeni di tRNA selC in Escherichia coli K-12 sono minimo trascurabile.

5. Preparazione di RNA

Nota: protocollo di preparazione di RNA The descritto qui è essenzialmente quella descritta dallo Varshney et al. 1; Per evitare deacilazione dei tRNAs aminoacylated durante la purificazione è importante conservare i campioni a pH acido e a 0 ° C durante tutto il corso della purificazione. Utilizzare tubi/boccette pulito sterile per tenere i campioni e le soluzioni e preparare tutte le soluzioni con ultrapura (18,2 MΩ·cm resistività) acqua.

  1. Pour 8 mL di ogni campione in una provetta da centrifuga ghiaccio-refrigerati. Centrifugare i campioni per 10 min a 9.500 x g a 4 ° C. completamente rimuovere surnatante e risospendere in acetato di sodio 0,3 mL freddo 0,3 M, pH 4,5 e 10 mM EDTA.
  2. Trasferire ciascun campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL freddo e aggiungere fenolo 0,3 mL equilibrata con lo stesso buffer.
    Nota: attenzione, fenolo produce fumi tossici ed è altamente corrosivo per la pelle.
  3. Vortex ciascun campione 10x per 15 s con almeno 1 min tra ogni vortice. Tra Vortex mantenere i campioni a 0 ° C. utilizzare le pause frequenti per garantire che i campioni rimangono freddi.
  4. Centrifugare i campioni per 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. trasferimento la fase acquosa (fase superiore) di nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL provette. Aggiungere come prima 0,3 mL freddo fenolo e vortice 4x15 s.
  5. Centrifuga per 10 min a 20.000 x g a 4 ° C. trasferimento la fase di acqua per microcentrifuga da 1,5 mL nuovo, freddo tubi contenenti 2,5 volte il volume di etanolo al 96% (~ 750 µ l). Precipiti il RNA incubando le provette per 1 h a-20 ° C, o a -80 ° C.
  6. Centrifugare i campioni per 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. eliminare il supernatante e attentamente aggiungere 1 mL di etanolo 70% freddo senza disturbare il pellet di RNA. Capovolgere delicatamente una volta per lavare l'interno dei tubi con etanolo.
    Nota: Il pellet può essere difficile da vedere in questa fase.
  7. Centrifuga per 10 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente rimuovere il supernatante e asciugare all'aria il pellet fino a quando non viene lasciato senza etanolo. Risospendere il pellet vigorosamente nel Vortex in 20 µ l freddo 10 mM sodio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA.
    Nota: Non asciugare troppo il pellet come diventerà difficile risospendere.
  8. Facoltativamente, valutare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza a 260 nm.
  9. Facoltativamente, valutare la qualità del RNA purificato da di elettroforesi su gel di agarosio 20.
  10. Esempi di store a -80 ° C.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
< classe p= "jove_title" > 6. Preparazione del campione di controllo chimicamente deacilata

Nota: per distinguere la banda di aminoacylated tRNA dal suo omologo deacilata il Northern blot, un deacilata aliquota è preparato chimicamente da trattamento alcalino. Maggior parte dei casi, è sufficiente deacylate un singolo campione per ogni macchia nordica.

Campione
  1. disgelo il RNA su ghiaccio. Trasferire un'aliquota di 4 µ l di campione di RNA ad un nuovo tubo. Aggiungere 46 µ l Tris-HCl pH 9.0. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
  2. Aggiungere 15 µ l di acetato di sodio 0,3 M a pH 4,5 e successivamente aggiungere 125 µ l di etanolo al 96%. Precipitare di RNA a-20 ° C per 1 h.
  3. Centrifuga per 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente rimuovere il surnatante e risospendere in 4 µ l freddo 10 mM sodio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, se il campione è conservato a -80 ° C.

7. Gel elettroforesi e macchiare nordico

  1. Mix 4 µ l di campione (non trattati o chimicamente deacilata) con 6 µ l tampone di caricamento (0.1 M sodio acetato (pH 5.0), 8m urea, 0,05% di blu di bromofenolo e 0.05% xilene cianolo).
    Nota: Ricordarsi di includere il campione contenente solo spike-in celle, il chimicamente deacilata campione (e il campione senza spike-in celle, se uno è stato preparato).
  2. Caricare i campioni su un 0.4 mm spessore 6,5% gel di poliacrilammide (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) contenenti urea 8 M in tampone di acetato di sodio 0.1 M (pH 5.0). Utilizzare gel lunga 60 cm per la corretta separazione delle specie di tRNA.
  3. Separare il RNA mediante elettroforesi in gel di 10 V/cm a 4 ° C, fino a quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel (~ 20 h).
  4. Zona di provenienza del colorante di xilene cianolo e 20cm giù verso il blu di bromofenolo colorante è usato per macchiare (la distanza tra i due coloranti dovrebbe essere 25-30 cm). Attentamente separare le lastre di due vetro, in modo che il gel rimane su uno di essi. Un sottile pezzo di carta da filtro è tagliato nella misura dell'area desiderata macchiante e posizionato sopra la parte del gel che verrà utilizzato per macchiare. Le parti del gel che non sono coperti da carta da filtro sono tagliate e scartate. utilizzare la carta da filtro per sollevare delicatamente il pezzo di gel dalla lastra di vetro.
    Nota: Il grande cuscinetto in gel è molto fragile quindi maneggiare con cura.
  5. Una membrana di nylon positivamente caricato (ad esempio Hybond N + membrana) è collocata sulla superficie del gel e trasferiti a 20 V per 90 min con 40 mM Tris-acetato (pH 8,1), 2 mM EDTA come buffer di trasferimento è.
  6. Crosslink RNA alla membrana tramite luce UV (0,12 J/cm 2).
    Nota: La membrana ora può essere conservata a temperatura ambiente e il protocollo può essere messo in pausa qui.

8. Progettazione e verifica delle sonde

Nota: un'attenta progettazione e verifica delle sonde di Northern blot è fondamentale per ottenere risultati affidabili ed evitare indesiderato cross-ibridazione con altre specie di RNA.

  1. Uso breve oligonucleotides sintetici come sonde. Progettare la sequenza di sonda in un modo che è complementare alla parte più singolare della sequenza del tRNA di interesse - questo è spesso il ciclo anticodone.
    Nota: Un elenco di sequenze di tRNA stimate da vari organismi può essere trovato nel tRNA Genomic Database (GtRNAdb) 21.
  2. Regolare la lunghezza della sequenza per ottenere una prevista fusione temperatura di 55-65 ° C.
  3. BLAST (base locale Alignment Search Tool) la vostra sequenza contro la sequenza del genoma del ceppo batterico utilizzato nell'esperimento, per verificare che la sequenza è unica per il tRNA selezionato, come descritto in 22.
    Nota: La tabella 1 elenca suggerito sonda sequenze per diversi tRNAs differenti di e. coli K12. Se la sonda è specifica per il tRNA di interesse, solo due bande sono visibili sulla macchia nordica (cariche e scariche tRNA) e solamente una banda è visibile nella corsia con il campione di deacilata (uncharged tRNA). Se più di due bande sono presenti o se ulteriore convalida della specificità della sonda è desiderato, vedere discussione.

9. L'ibridazione della macchia nordica

Nota: nei passaggi seguenti, la membrana è in sequenza ibridata con sonde complementari per i tRNAs specifico desiderato, tra cui una sonda specifica per il riferimento tRNA selC.

  1. Posizionare la membrana in un tubo di ibridazione e aggiungere 6 mL di soluzione di ibridazione (0,9 M di NaCl, 0.05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (p/v) SDS, 100 mg/mL di tranciati e denaturazione del DNA di sperma di aringhe e 5 x Denhardt ' soluzione s (100 x Denhardt ' soluzione s = 2% di albumina di siero bovino, polivinilpirrolidone 2% 40 e 2% Ficoll)).
  2. Pre-ibridare la membrana nel buffer per 1 h a sonda di 42 ° C. aggiungere 30 pmol radioattivo oligo-DNA 5 girevole ' - fine - etichettati con 32 P (preparato come descritto da Sambrook et al. 23)
    Nota: attenzione, le emissioni di beta ad alta energia da 32 P possono presentare un sostanziale della pelle e degli occhi dose pericolo. Corretta precauzione dovrebbe essere presa quando usando 32 P. radioattivo rifiuti deve essere smaltito secondo i protocolli di sicurezza istituzionali adeguati.
  3. Incubare la sonda con la membrana durante la notte rotante a 42 ° C. Rimuovi la sonda utilizzando una pipetta monouso da 10 mL.
    Nota: Se conservati in un congelatore la sonda può essere riutilizzata.
  4. Nel tubo di ibridazione, lavare la membrana poco in 50 mL di 0,3 M di NaCl, 30mm citrato di sodio, 0,1% (p/v) SDS a temperatura ambiente.
    Nota: Questo primo lavaggio contiene molto non associato sonda e deve essere gestito come altamente radioattivo.
  5. Ripetere passo 9.4 una volta, quindi spostare la membrana in un contenitore in plastica piatta o vassoio con un coperchio. Coprire la membrana con la soluzione di lavaggio (0,3 M di NaCl, 30mm citrato di sodio, 0,1% (p/v) SDS) e Incubare 30 min a temperatura ambiente.
  6. Modificare la soluzione di lavaggio e continuare il lavaggio fino a quando un soddisfacente rapporto segnale-rumore è stato ottenuto (spesso 3-4 cambi di soluzione di lavaggio). Utilizzare un tubo Geiger-Müller per rilevare come il rapporto segnale rumore cambia misurando la radiazione da un'area vuota della membrana e confrontarlo con l'area dove la sonda ha ibridato specificamente al tRNA.
  7. Al fine di essere in grado di rimuovere la sonda dalla membrana dopo l'esposizione, garantire che (importante) la membrana non si asciughi prima della procedura di "stripping". Posizionare la membrana in un sacchetto di plastica sottile o un involucro e fissarlo con plastica avvolgere e sigillarlo per essere a tenuta d'aria di nastro o saldatura. Posizionare la membrana sigillata in una schermata di phosphorimaging.
    Nota: Il tempo di esposizione richiesto sullo schermo di phosphorimaging è determinato dall'attività specifiche della sonda, la quantità di RNA sondato for e l'efficienza di ibridazione della sonda e può variare notevolmente; da pochi minuti ad alcuni giorni. Con esperienza, l'intensità della radiazione rilevata sulla membrana con il tubo Geiger-Müller dà una buona indicazione del tempo di posa richiesto. Per la quantificazione affidabile, è importante che lo schermo non è sovraesposta.
  8. Sullo schermo di phosphorimaging utilizzando un laser scanner per la scansione e salvare il file in " .gel " formato.
    Nota: Un alto rapporto segnale-rumore è necessario per la quantificazione affidabile. Sondaggio per un tRNA dovrebbe tradursi in due bande; aminoacylated contenente un tRNA (più lenta migrazione) e uno contenente deacilata tRNA (più veloce migrazione). Vedere la Figura 2.

10. Stripping della membrana

Nota: prima che la membrana può essere sondata per un altro tRNA, la sonda precedente deve essere rimosso prima mettendo a nudo la membrana.

  1. Calore abbastanza stripping buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM di citrato di sodio, 0,1% (p/v) SDS) per coprire la membrana e versare sopra la membrana. Incubare 15 min a temperatura ambiente.
  2. Ripetere il punto 10.1 fino a nessuna radiazione può essere rilevato con un tubo Geiger-Müller; la membrana può ora essere ri-ibridata seguendo la procedura descritta nella sezione 9.

11. Quantificare il tRNA e livelli di carica

  1. caricare il file di .gel nell'imaging software (Vedi la Tabella materiali). Tracciare una linea verticale lungo ciascuna delle corsie del campione in modo tale che si estende su gran parte della larghezza della corsia, ma esclude i bordi delle fasce dove il segnale può essere irregolare, come mostrato in Figura 3A.
  2. Visualize conta da ogni corsia facendo " analisi "-> " creare grafico ". Definire manualmente le due cime che rappresentano la carica e il tRNA uncharged da ogni corsia, come mostrato nella Figura 3B.
  3. Ottenere conteggi da ogni picco cliccando " analisi "-> " relazione sulla zona di " e registrare l'area sotto ciascuno dei due picchi.
  4. Quando la macchia è stata sondata per tRNA selC e almeno un tRNA di interesse, normalizzare i livelli del tRNA di interesse per tRNA selC.
    1. Calcolare la proporzione di tRNA che proviene dalle cellule spike-in ogni corsia e sottrarre dal segnale totale in quanto Vicolo usando l'equazione:
      figure-protocol-3
      Nota: qui, TRNA di esempio = il segnale ottenuto da una sola corsia di una membrana sondata per il tRNA desiderata; Campione selC = il segnale ottenuto dalla stessa corsia della membrana stessa sondata per tRNA selC; Ref tRNA = il segnale ottenuto dalla corsia contenente RNA solo spike-in cella della membrana stessa sondato per il tRNA desiderata; Ref selC = il segnale ottenuto dalla corsia contenente RNA solo spike-in cella della membrana stessa sondato per tRNA selC.
    2. Per normalizzare, dividere il valore corretto di tRNA da ogni corsia per il segnale di selC tRNA da stessa corsia.
      Nota: Il contributo al segnale selC tRNA dalle cellule campionate è trascurabile (vedere la Figura 2, lane etichettato "-selC ").
  5. Calcolare il livello per ogni corsia di carica dividendo il segnale del picco che rappresenta la carica tRNA con la somma del segnale da due cime di tRNA (carica + uncharged).

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Risultati

Utilizzando la procedura descritta qui, l'abbondanza e ricarica i livelli di tre tRNAs sono stati misurati in e. coli K-12 prima e durante l'inedia dell'aminoacido.

Il auxotroph di arginina ceppo NF9154 (thr leu suo argH thi mtl supE44) è stato coltivato per almeno dieci generazioni in MOPS supplementato con 0,4% glicerolo, 50 µ g/mL treonina, leucina, arginina e istidina di 5 µ g/mL a 3...

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Discussione

Questo protocollo descrive come misurare contemporaneamente il livello di carico delle specifiche Escherichia coli tRNAs e confrontare i livelli relativi dei tRNAs in diversi campioni. I punti critici del protocollo sono 1) per gestire i campioni in modo che i livelli di carica tRNA cellulare vengono mantenuti, 2) per normalizzare la quantità di tRNA in modo tale che i livelli relativi di tRNA in diversi campioni possono essere paragonati in modo affidabile e 3) per garantire la sp ecificity delle sonde selezion...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Marit Warrer per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio danese per la ricerca indipendente | Scienze naturali [1323-00343B] e la Fondazione di ricerca nazionale danese [DNRF120].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
UreaMerck57-13-6Purezza >99%
PoliacrilammideServa79-06-7
Bis (N,N'-Metilene-bis-acrilammide)BIO-RAD161-0201
Acido tricloroacetico (TCA)Sigma76-03-9
FenoloMerck108-95-2
IPTG
Glucosio
, Acetato
EDTA,
Etanolo
, Tris,
acido
cloruro di
NaH2PO4
Citrato
SDS
aringa sperma DNASigma100403-24-5
BSA
Polivinilpirrolidone
Ficoll
P32 γ ATPPerkin Elmer
DNA oligo (sonde)TAG Copenhagen
Hybond N+ membranaGE HealthcareRPN203B
Crosslinker
ElectroblotterBIO-RAD
Typhoon FLA 7000 ScannerGE Healthcare28955809
Spettrofotometro
Forno
Geiger-Mü provetta per ller
Schermo imager al fosforoGE Healthcare
Provetta
Fiasche
microcentrifuga da 1,5
ml Provette per centrifuga da 20 ml
strong>NameAziendaNumero di catalogoComments
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft
di sodio,cloridrico, sodio, di sodiodi idratazioneper ibridazionedi colturaProvette per<

Riferimenti

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