La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.
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Articolo metodologico
AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Chiarire i fattori che dirigono l'organizzazione spazio-temporale dell'evoluzione tessuti è uno degli scopi principali nello studio dello sviluppo. Varie proposte sostengono di essere stati importanti contributi alla comprensione delle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti nella loro organizzazione spazio-temporale in diversi processi morfogenetici e di sviluppo. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti affidabili e accessibili per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo, convalida di queste ipotesi è stata difficile. Qui presentiamo metodi che impiegano la microscopia a forza atomica (AFM) e particle tracking con l'obiettivo di quantificare le proprietà meccaniche della cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Epiboly è un processo inerente allo sviluppo conservato precoce cui studio è facilitata dalla trasparenza dell'embrione. Questi metodi sono ampiamente applicabili, affidabile e semplice da implementare poiché essi superare gli interventi intrusivi che potrebbero influire sulla meccanica del tessuto. È stata applicata una strategia semplice per il montaggio di campioni, registrazione di AFM e iniezioni di nanoparticelle e il rilevamento. Questo approccio rende questi metodi facilmente adattabile ad altre volte inerente allo sviluppo o organismi.
Introduzione
I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l'esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione1 o Video microscopia di forza2 permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia3o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate4 o in vivo 5
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Protocollo
Tutti i passaggi di protocollo descritti di seguito seguono le indicazioni di cura degli animali delle nostre istituzioni.
1. Zebrafish cultura
- Allevare e mantenere zebrafish adulto in condizioni standard.
Nota: AB e TL embrioni di tipo selvaggio sono stati utilizzati per questo studio. - Raccogliere gli embrioni e farli crescere a 28,5 ° C in E3 embrione medio24. Loro fase secondo morfologia come descritto in precedenza19.
2. atomic Force Microscopy
- Manuale dechorionate in scena gli embrioni di zebrafish (di età diverse secondo ....
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Risultati
Misure di tensione corticale
Per ogni punto di misura, cinque curve di forza-spostamento (F-z) sono state acquisite da AFM di dilagare il cantilever a 1 Hz con un'ampiezza di picco-picco di 5 µm (velocità = 10 µm/s) fino a un rientro massimo di ~ 2 µm. Questa procedura stava prendendo meno di 20 minuti e non è stata colpita dalla progressione di epiboly. Ogni condizione sperimentale è stato testato in almeno 5 embrioni.
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Discussione
Qui indichiamo che le proprietà del materiale e alcuni parametri biomeccanici della cella tuorlo zebrafish durante epiboly possono essere prontamente stimati mediante AFM e nanoparticelle microrheology.
Mentre AFM è stato impiegato per recuperare le caratteristiche reologiche di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche4,5,25,28, qui abbiamo sviluppato un protocol.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille per partecipare alla configurazione di base per questi protocolli. Ringraziamo anche la piattaforma di Imaging molecolare dalla IBMB-PCB, Xavier Esteban e membri del laboratorio per il continuo supporto. Il programma di gruppi consolidati della Generalitat de Catalunya e DGI e Consolider sovvenzioni dal Ministero dell'economia e competitività della Spagna all'EMB e DN supportato questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio ottico invertito | Nikon | TE2000 | Visualizzazione del campione e del cantilever AFM |
| Microscopio a forza atomica (AFM) | Su | misura-Qualsiasi | AFM commercializzato potrebbe essere impiegato |
| Microscopio confocale invertito | Zeiss | LSM780 | Raccolta dati nanooreologici |
| Agarosio D1 Basso EEO | Conda | 8016.00 | Fusione di |
| embrioniLMP ultrapuro Agarosio (basso punto di fusione) | Invitrogen | 16520-100 | Fissaggio degli embrioni Stampi per |
| microiniezione e trapianto di pesce zebra World | Precision Instruments | Z-MOLDS | Fusione di embrioni. Realizzato su misura con le dimensioni originali può essere impiegato anche |
| Dumont 5 Pinze | FST | 11251-20 | 1,5 mm |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT. GS | Misurazione dell'embrione mediante AFM. Punta sferica: 4,5 & micro; m diametro e k=0,01 N/m |
| Nanoparticelle fluorescenti | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | per il monitoraggio della nanoreologia |
| Estrattore di micropipette | Sutter Instruments | P-2000 | Fabbricazione di microaghi su misura |
| Vetro capillare borosilicato | Warner | Instruments G100TF-4 | Fabbricazione di microaghi su misura |
| Micromanipolatore | Narishige | MN-153 | Manipolazione della micropipetta |
| Microiniettore | Eppendorf | FemtoJet Express | Controllo del tempo e della pressione |
| di iniezione Stereomicroscopio | Leica | DFC365FX | Visualizzazione degli embrioni durante l'iniezione Software di |
| analisi | MathWorks | Matlab | Analisi dei dati AFM e di tracciamento delle particelle |
| Zebrafish | AB e TL wild type | - | Ceppi utilizzati per la raccolta di embrioni |
| Piastre di fondo in vetro | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Montaggio di embrioni per la raccolta di dati nanoreologici |
| Micrometro da stadio | FST | 29025-02 | Misurazione del volume di iniezione |
Riferimenti
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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Ristampe e permessi
