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Articolo metodologico

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

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DOI:

10.3791/56224

⸱

29 novembre 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

In questo articolo

Sommario

La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

Abstract

Chiarire i fattori che dirigono l'organizzazione spazio-temporale dell'evoluzione tessuti è uno degli scopi principali nello studio dello sviluppo. Varie proposte sostengono di essere stati importanti contributi alla comprensione delle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti nella loro organizzazione spazio-temporale in diversi processi morfogenetici e di sviluppo. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti affidabili e accessibili per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo, convalida di queste ipotesi è stata difficile. Qui presentiamo metodi che impiegano la microscopia a forza atomica (AFM) e particle tracking con l'obiettivo di quantificare le proprietà meccaniche della cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Epiboly è un processo inerente allo sviluppo conservato precoce cui studio è facilitata dalla trasparenza dell'embrione. Questi metodi sono ampiamente applicabili, affidabile e semplice da implementare poiché essi superare gli interventi intrusivi che potrebbero influire sulla meccanica del tessuto. È stata applicata una strategia semplice per il montaggio di campioni, registrazione di AFM e iniezioni di nanoparticelle e il rilevamento. Questo approccio rende questi metodi facilmente adattabile ad altre volte inerente allo sviluppo o organismi.

Introduzione

I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l'esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione1 o Video microscopia di forza2 permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia3o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate4 o in vivo 5 o nanoparticelle microrheology6 consentire l'anticipazione di un tessuto proprietà meccaniche e le risposte.

AFM è una tecnica topografica tridimensionale con risoluzione atomica ad alta risoluzione di rugosità superficiale e rispetto dalla deflessione di suggerimenti a sbalzo a contatto con una superficie sondati7. Diverse metodologie che impiegano AFM sono stati sviluppati per studiare proprietà di superficie, compresa la misurazione di attrito, le forze di adesione e proprietà viscoelastiche dei materiali diversi. Recentemente, AFM è emerso come un potente strumento per recuperare le informazioni sulle proprietà meccaniche dei campioni biologici. In particolare, AFM non invadente può estrarre il modulo di taglio complesse da singole cellule applicando oscillatori rientranze con un micro suggerimento attaccato a uno sbalzo di noto curvatura costante8. Questo ci permette di dedurre le forze risultanti. Eppure, AFM non è univoco e diverse metodologie consentono di estrarre dati reologici e proprietà meccaniche da singole celle (ad esempio, micropipetta aspirazione9, magnetico torsione cytometry (MTC)10o uniassiale trazione test11).

Ancora, l'applicazione di queste nuove metodologie a complessi processi morfogenetici non è semplice. Le sfide principali affrontate nel determinare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali sono il piccolo (µm a mm), morbido (nel 102 - 104 Pa gamma) e natura visco-elastico (dando luogo a fenomeni dipendenti dal tempo) del materiale12. È pertanto importante adeguare i metodi impiegati per la determinazione delle proprietà meccaniche (rigidezza, viscosità, adesione) per il caso specifico di embrioni e di organismi in via di sviluppo. Due questioni importanti devono essere prese in considerazione quando si analizzano reologici approcci nello studio dello sviluppo: per evitare interferenze invadente e per fornire facile accessibilità. In questo scenario, l'aspirazione micropipetta, MTC e prove di trazione presentano limitazioni. Nel primo caso, all'elevata deformabilità che soffre di una cella potrebbe alterare le proprietà fisiologiche e meccaniche9. Nel secondo caso, la necessità di aderire saldamente al tessuto sperimentale di un substrato per garantire che le sollecitazioni impresse deformano il citoscheletro localmente potrebbe anche introdurre effetti sullo stato di attivazione delle cellule e, quindi, nelle loro caratteristiche meccaniche10 . Approcci di trazione monoassiali, ultimi sono limitati dalla geometria di sviluppare organismi e accessibilità11.

AFM sembra essere più adatto per lo studio dei processi di sviluppo in quanto permette lo studio di campioni biologici direttamente nel loro ambiente naturale senza alcuna preparazione del campione ingombrante. Inoltre, come dissociazione di tessuti embrionali è generalmente difficile, la ridotta dimensione delle sonde AFM fornisce un alto grado di versatilità con nessuna limitazione nella scelta del tipo di media (acquoso o non acquoso), la temperatura del campione o prodotto chimico composizione del campione. AFM è abbastanza versatile per essere applicato a domini di grandi dimensioni e scale del tempo ed è stato impiegato per recuperare le proprietà materiali dei tessuti in condizioni fisiologiche o distinte fasi di sviluppo. Tessuti intero nativi come arterie13 o ossa14 sono state studiate dal punto di vista topografico e in alcuni casi, come la sclera, proprietà meccaniche sono stati anche estratto15. Topografia è stato esplorato anche in streaming in embrioni permettendo la visualizzazione di, per esempio, la riorganizzazione a cellula durante la morfogenesi in Xenopus16. Protocolli della preparazione del campione globale, ultimo sono state sviluppate per determinare i parametri meccanici durante diversi processi di sviluppo. La nanoindentazione mappe sono state generate su sezioni di tessuto nativo non fissati per il pulcino embrionali digerente11; Proprietà adesive e meccaniche estratto per le singole celle di ectoderma, mesoderma ed endoderma progenitrici isolate da gastrulating zebrafish embrioni4; misurazioni di rigidità per l'epiblasto e linea primitiva su espianti da embrioni aviari17; e un modello distinto di gradienti di rigidità sono definiti direttamente nel cervello embrionale di Xenopus5.

Un salto di qualità notevole per l'applicazione di AFM per esplorare lo sviluppo embrionale può venire da avvicinando semplici accessibili processi morfogenetici. Epiboly di zebrafish è un evento essenziale e conservato, in cui diversi tessuti coordinano in uno spazio ristretto sferico per dirigere l'espansione del blastoderm in poche ore. Al momento della comparsa di zebrafish epiboly (fase sferica), uno strato superficiale di cellule, lo strato avvolgente (EVL), copre una calotta semi-sferica di blastomeri centrata sul polo animale dell'embrione che si siede su una cellula sinciziale tuorlo massiccia. Epiboly consiste dell'espansione corticale ward vegetale dell'EVL, cellule profonde (DCs) il blastoderm, e lo strato esterno della cellula sinciziale tuorlo (E-YSL) intorno al tuorlo. Epiboly si conclude con la chiusura dell'EVL e i controller di dominio al palo vegetal18,19,20. Come e dove le forze sono generate durante epiboly e come sono accoppiate a livello globale non è ancora chiaro1,21.

Qui descriviamo in dettaglio come applicare AFM per dedurre proprietà meccanica passiva del tessuto durante la progressione di epiboly in zebrafish tuorlo delle cellule in vivo. A tale scopo, abbiamo impiegato le piccole microsfere attaccate al cantilever AFM come sonde. Questo consente il recupero di informazioni locale precise all'interno della superficie delle cellule di tuorlo non uniforme e di studiare tensionale gradienti e le loro dinamiche nel tempo. Si avvicina a AFM alternativi come quelli che usano Cuneo cantilever22, saranno dati locali non rendering che sono sufficientemente precisi. La tecnica di Cuneo, che richiede le abilità di manipolazione molto attenta ad incollare una fetta più grande della dimensione del campione all'estremità del cantilever, non è adatta per il sondaggio dell'embrione (~ 2 volte più grande rispetto alla lunghezza dello sbalzo) meccanica.

Modellazione e caratterizzare le proprietà viscoelastiche delle cellule in modo qualitativo e quantitativo consente una migliore comprensione dei loro biomeccanica. Da un punto di vista biomeccanico, è essenziale comprendere epiboly e non solo richiesta conoscenza sulle misurazioni di tensione corticale e dinamiche, che possono essere estratti da AFM; così c'è bisogno di informazioni sulle proprietà biofisiche del tessuto. Per estrarre queste informazioni, una varietà di cellula reologia tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni al fine di caratterizzare i diversi tipi di cellule sotto diverse condizioni fisiologiche23. Essi includono AFM, MTC e pinzette ottiche (OT). Questi metodi, tuttavia, sono stati dimostrati inadeguati per mesoscopiche analisi a scala di embrioni o di organi. In alternativa, abbiamo adattato con successo nanoparticle tracking microrheology6 per in vivo misure reologiche. Questa tecnica analizza gli spostamenti browniani delle singole particelle e vengono dedotte le proprietà locali micromeccanici.

Insieme microrheology AFM e nanoparticelle consentono la definizione delle dinamiche tensionale corticale e proprietà meccaniche interne del tuorlo durante epiboly. Queste informazioni approva pienamente un modello in cui anisotropo stress si sviluppa in conseguenza delle differenze nella risposta deformazione dell'EVL e strato citoplasmico tuorlo (YCL) alla contrazione di actomiosina isotropo della corteccia E-YSL è essenziale per il movimento netto direzionale della progressione EVL ed epiboly1.

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Protocollo

Tutti i passaggi di protocollo descritti di seguito seguono le indicazioni di cura degli animali delle nostre istituzioni.

1. Zebrafish cultura

  1. Allevare e mantenere zebrafish adulto in condizioni standard.
    Nota: AB e TL embrioni di tipo selvaggio sono stati utilizzati per questo studio.
  2. Raccogliere gli embrioni e farli crescere a 28,5 ° C in E3 embrione medio24. Loro fase secondo morfologia come descritto in precedenza19.

2. atomic Force Microscopy

  1. Manuale dechorionate in scena gli embrioni di zebrafish (di età diverse secondo interessi individuali). Rimuovere chorions con due pinze sottili e taglienti (Vedi Tabella materiali).
    1. Il corion utilizzando una pinza di presa e fare uno strappo in essa con le altre pinze. Poi, tenendo il corion in una regione opposta a quella dello strappo, spingere l'embrione delicatamente attraverso l'apertura.
    2. Eseguire il dechorionation sotto un dissezione stereomicroscopio con un range impostabile di ingrandimento tra 8 X e 50 X.
  2. Montare gli embrioni per AFM
    1. Preparare una soluzione di agarosio al 2% nel mezzo di embrione e riempire una scatola di Petri 35mm con questo. Lasciare solidificare. Fare piccoli fori di 1.5 mm di diametro (due volte le dimensioni dell'embrione) e profondità di circa 350 µm (metà delle dimensioni dell'embrione) con una pinza sottile nel letto dell'agarosi.
    2. Posizionare gli embrioni in poke fatta nello strato di agarosio e assicurare che sono in luogo di diffondere intorno a una soluzione di 0,5% basso dell'agarosi nel mezzo di embrione di fusione. Versare questa soluzione intorno solo gli embrioni per fissarle nei fori.
    3. Prima l'agarosi di basso punto di fusione si solidifica a temperatura ambiente, ruotare gli embrioni in modo tale che la regione di interesse per essere sondati da AFM dovrà affrontare verso l'alto (Figura 1A).
  3. Esaminare gli embrioni di AFM
    1. Individuare e gli embrioni in di Petri che impiegano un obiettivo X 20 in un microscopio a forza atomica invertito dell'immagine (Vedi Tabella materiali25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
      Nota: Gli embrioni vengono mantenuti attive immerso nel mezzo di embrione e attaccato al letto dell'agarosi.
    2. Sonda di superficie delle cellule di tuorlo di casted embrioni che impiegano sferiche perle di polistirolo di 4,5 µm di diametro collegato a un cantilever con una costante primavera nominale di 0.01 N/m. impostare l'ampiezza di picco-picco di oscillazione a sbalzo a 5 µm e la sua frequenza di 1 Hz.
    3. Raccogliere dati per ogni regione per essere testato in diverse posizioni e in vari embrioni, come una routine, per una media di dati.
      Nota: Un buon punto di partenza è a cinque posizioni situati al centro e gli angoli di un quadrato di µm 10 µm x 10 controllando la posizione a sbalzo con gli azionatori piezo-elettrici XY del microscopio AFM della sonda. Raccolta dati e la formazione immagine ha preso circa 20 minuti per embrione. Registrazione dei dati in diverse regioni della superficie delle cellule di embrione tuorlo, ad es., il palo vegetal o diverse regioni vicino al margine di cellule EVL (Figura 1B e 1C), può essere solo fatto impiegando esemplari distinti orientati in modo diverso.
  4. Calcolare le forze
    1. Misurare lo spostamento verticale del cantilever AFM (z) con sensori estensimetrici accoppiati per azionatori piezo-elettrici e la sua flessione (d) utilizzando un fotodiodo quadrante dal metodo ottico leva con il software di controllo del microscopio (Vedi Tabella materiali 25).
    2. Utilizzare la pendenza di una curva d-z ottenuta da dati raccolti da una regione nuda del vetrino coprioggetti per calibrare la correlazione tra il segnale di fotodiodo e la deflessione del cantilever (d).
      Nota: Lo spostamento verticale misurato è uguale la deflessione a sbalzo e la pendenza rappresenta la sensibilità di deflessione della leva ottica26.
    3. Dedurre che la costante elastica a sbalzo (k) dalle fluttuazioni termiche come precedentemente descritto27.
    4. Come si calcola il rientro del campione (h):
      h = (z - zc) -(d - di)          (1)
      Nota: Qui zc è la posizione del punto di contatto e dfuori è l'offset del fotodiodo.
    5. Calcolare la forza (F) su cantilever come:
      F = k · d (2)
  5. Calcolare la tensione della corteccia in termini di un modello di liquido-palloncino costituito da uno strato elastico di tensione corticale Tc che racchiude un liquido viscoso. In questo modello, per piccole intaccature (in rispetto alla dimensione dell'embrione), la forza aumenta proporzionalmente4,,28 , come:
    F = 4 π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
    Nota: Qui Rb è il raggio del cordolo e Re è il raggio dell'embrione. Per l'embrione di zebrafish, come il raggio dell'embrione (400 µm) è a due ordini di grandezza maggiori di quella del tallone (2,25 µm), questa equazione può essere approssimata come:
    F = 4 π Tc h (4)
    1. Calcolare vigore il tensionamento-rientro (F-h) curve in ogni regione di cella embrione tuorlo per cinque diverse misure puntuali.
    2. Calcolare la Tc per ogni F-h curva di raccordo minimi quadrati non lineari. Per l'analisi statistica, la tensione corticale Tc calcolata deve essere mediato da diversi F- curveh .
  6. Misurare le proprietà viscoelastiche (Reologia) della corteccia applicando ampiezza bassa (100 nm) oscillazioni multifrequenza durante AFM è composta da onde sinusoidali di diverse frequenze25.
    1. Calcolare un efficace modulo complesso g*(ƒ) nel dominio della frequenza, le curve di rientro di forza come:
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
      qui i è l'unità immaginaria e F(f) e h(f) sono gli spettri di frequenza (f) di forza e di rientro. b è la correzione per il trascinamento viscoso su cantilever estratte dalle oscillazioni applicate sulla superficie.
    2. Separato g*(ƒ) in parti reali e immaginarie, come:
      g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6)
      em > g'(f) è il modulo elastico ed è una misura dell'energia elastica memorizzata e recuperata per ciclo di oscillazione. g' (f) è il modulo viscoso che rappresenta l'energia dissipata.
    3. Calcolare la tangente di perdita, che fornisce un indice di solido-come (< 1) o simil-liquido (> 1) comportamento del materiale, come:
      g' (f) / g' (f)          (7)
      Nota: Con questo tipo di misurazione, è possibile estrarre i parametri che indicano come viscoso ed elastico come è il materiale sondato. Anche se leggermente b dipende dalla distanza dell'estremità del cantilever alla superficie, dati i valori molto bassi di g´ ´ esposto dal tuorlo cella (vedere Figura 2D qui sotto), piccole variazioni di b hanno un impatto trascurabile le misure29.

3. particle Tracking Microrheology

  1. Eseguire microiniezione di particella nella cella tuorlo
    1. Fabbrichi i microaghi su misura utilizzando un estrattore orizzontale micropipetta e capillare in vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali).
      1. Preparare i microaghi che hanno un diametro esterno di 1,00 mm, un diametro interno di 0,58 mm e una lunghezza di 10 cm utilizzando impostazioni di estrattore: pressione: 500; Calore: 510; Pull: 65; Velocità: 25; Tempo: 50.
    2. Preparare una piastra di Petri di iniezione creando corsie di rientro dritto in un 1% di agarosio nel letto medio dell'embrione che impiegano muffe fatte su ordinazione (Vedi Tabella materiali).
      1. Capovolgere gli stampini e metterli sulla superficie del gel di agarosio liquido e rimuovere gli stampi, una volta che il gel si è solidificato. Dispensare gli embrioni nelle scanalature fatta dalla muffa in agarosio sotto un dissezione stereomicroscopio con ingrandimenti 1.2.
        Nota: La larghezza e la progettazione degli stampi abilitare gli embrioni per self-allineare.
    3. Prima dell'iniezione, quasi completamente rimuovere il mezzo per facilitare l'iniezione (la tensione superficiale che l'embrione/corion incolli all'ago durante la rimozione dopo l'iniezione).
    4. Microinject nanoparticelle fluorescenti (raggio un = 100 nm, Vedi Tabella materiali) diluito in acqua (1:1, 000) nella parte vegetale della cella embrione tuorlo (Figura 3A).
    5. Regolare la micropipetta con micromanipolatori precisione e iniettare le perline con un microinjector automatico con controlli di tempo e pressione (Vedi Tabella materiali). Impostare la pressione tra 10 e 20 psi.
    6. Prima di iniettare la soluzione di perlina, calibrare il volume da iniettare (0,5 nL) misurando la dimensione delle gocce consegnato dalla microinjector con un micrometro oggetto 1 x 0,01 mm (Vedi la Tabella materiali).
    7. Impiegare un ingrandimento di 1.6 X nella dissezione stereomicroscopio per visualizzare gli embrioni durante le iniezioni, che vengono eseguite a temperatura ambiente.
  2. Valutare il comportamento viscoelastico del tuorlo registrando le fluttuazioni termiche
    1. Dechorionate gli embrioni iniettati come nel passaggio 2.1 e incorporarli in un basso di 0,5% fusione punto agarosio in soluzione medio embrione a 30 ° C. In seguito, trasferirli su piastre di fondo di vetro (Vedi Tabella materiali) e orientare e spingerli verso il coprioggetto quando l'agarosio è ancora liquido.
      Nota: Quando l'agarosio si solidifica a temperatura ambiente, gli embrioni sono pronti per essere imaged.
    2. Posizionare gli embrioni montati nelle piastre di fondo di vetro sul palco di un microscopio invertito confocale 2h dopo microiniezione. Catturare le immagini delle nanoparticelle per 26 s a una frequenza di campionamento di 25 Hz con un obiettivo X 63 a temperatura ambiente in un microscopio confocale invertito che impiegano il software microscopio commerciale standard (dimensione dei pixel = 166 nm, immagini catturate ogni 40 ms).
    3. Calcolare la posizione di centroidi le particelle e definire le loro traiettorie nel tempo con il plugin TrackMate dell'open source software ImageJ (Figura 3B).
    4. Calcolare il dislocamento di Mean Square bidimensionale (MSD) di ogni particella con software su misura6,30 come:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      Nota: Qui t è il tempo trascorso e il tempo di ritardo. In un liquido viscoso puro, il MSD aumenta inversamente con viscosità (ν) secondo la relazione di Stokes-Einstein:
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      dove T è la temperatura assoluta.

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Risultati

Misure di tensione corticale
Per ogni punto di misura, cinque curve di forza-spostamento (F-z) sono state acquisite da AFM di dilagare il cantilever a 1 Hz con un'ampiezza di picco-picco di 5 µm (velocità = 10 µm/s) fino a un rientro massimo di ~ 2 µm. Questa procedura stava prendendo meno di 20 minuti e non è stata colpita dalla progressione di epiboly. Ogni condizione sperimentale è stato testato in almeno 5 embrioni.

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Discussione

Qui indichiamo che le proprietà del materiale e alcuni parametri biomeccanici della cella tuorlo zebrafish durante epiboly possono essere prontamente stimati mediante AFM e nanoparticelle microrheology.

Mentre AFM è stato impiegato per recuperare le caratteristiche reologiche di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche4,5,25,28, qui abbiamo sviluppato un protocol...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille per partecipare alla configurazione di base per questi protocolli. Ringraziamo anche la piattaforma di Imaging molecolare dalla IBMB-PCB, Xavier Esteban e membri del laboratorio per il continuo supporto. Il programma di gruppi consolidati della Generalitat de Catalunya e DGI e Consolider sovvenzioni dal Ministero dell'economia e competitività della Spagna all'EMB e DN supportato questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio ottico invertitoNikonTE2000Visualizzazione del campione e del cantilever AFM
Microscopio a forza atomica (AFM)Sumisura-QualsiasiAFM commercializzato potrebbe essere impiegato
Microscopio confocale invertitoZeissLSM780Raccolta dati nanooreologici
Agarosio D1 Basso EEOConda8016.00Fusione di
embrioniLMP ultrapuro Agarosio (basso punto di fusione)Invitrogen16520-100Fissaggio degli embrioni Stampi per
microiniezione e trapianto di pesce zebra WorldPrecision InstrumentsZ-MOLDSFusione di embrioni. Realizzato su misura con le dimensioni originali può essere impiegato anche
Dumont 5 PinzeFST11251-201,5 mm
Si3N4 cantileverNovascanPT. GSMisurazione dell'embrione mediante AFM. Punta sferica: 4,5 & micro; m diametro e k=0,01 N/m
Nanoparticelle fluorescentiLife TechnologiesFluoSpheres F8811,per il monitoraggio della nanoreologia
Estrattore di micropipetteSutter InstrumentsP-2000Fabbricazione di microaghi su misura
Vetro capillare borosilicatoWarnerInstruments G100TF-4Fabbricazione di microaghi su misura
MicromanipolatoreNarishigeMN-153Manipolazione della micropipetta
MicroiniettoreEppendorfFemtoJet ExpressControllo del tempo e della pressione
di iniezione StereomicroscopioLeicaDFC365FXVisualizzazione degli embrioni durante l'iniezione Software di
analisiMathWorksMatlabAnalisi dei dati AFM e di tracciamento delle particelle
ZebrafishAB e TL wild type- Ceppi utilizzati per la raccolta di embrioni
Piastre di fondo in vetroMat TekP35G-0.170-14-CMontaggio di embrioni per la raccolta di dati nanoreologici
Micrometro da stadioFST29025-02Misurazione del volume di iniezione
diametro

Riferimenti

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