Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.
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Articolo metodologico
Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Complessi cambiamenti nell'espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l'intero gene espressione risposta all'ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l'esposizione all'ipossia. L'ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N2 gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l'espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 - 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell'espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l'esposizione di O2 e concomitanti cambiamenti nell'espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all'interno dell'ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O2-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all'ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.
Introduzione
Molti organismi rispondono all'ipossia, o basso O2, alterando gene expression 1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox 4. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all'ipossia 5,6,7,<....
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Protocollo
1. indurre ipossia
- Un giorno o più prima del corso di tempo di ipossia: preparare l'incubatrice, cellula filtraggio sistema, vuoto, serbatoio di gas, boccette, tappi, tubazione di vetro e tubi, come indicato nella Tabella dei materiali.
- Posizionare il serbatoio2 N, incubatrice, sistema di aspirazione e filtraggio nelle immediate vicinanze, per attivare l'elaborazione rapida delle cellule.
- Preparare terreno YPD liquido sterile (1%, Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio) con i componenti in una bottiglia di vetro e la sterilizzazione in autoclave.
- Planimetria di boccette in incubatrice.
Not....
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Risultati
Il decorso di ipossia e RNA-seq analisi sono state eseguite in modo indipendente tre volte. Per esaminare la riproducibilità dei tre replicati, dati di espressione genica per tutti i geni è stati analizzati utilizzando Principal Component Analysis (PCA). La figura 2 Mostra come i campioni cambiano sopra i primi due componenti principali, che insieme rappresentano il 58,9% della variabilità. Questa analisi ha indicato che ogni corso tempo esibisce i cambiament.......
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Discussione
In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l'ipossia nel lievito S. cerevisiae. L'obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N2 in contenuti multi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'Istituto Lewis-Sigler per Integrative Genomics Sequencing Core Facility all'Università di Princeton per consulenza tecnica e per il sequenziamento e preparazione di RNA biblioteca. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Rowan University e NIH NIGMS R15GM113187 a Boy
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatore a secco chiuso | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set a 30 °C. Modificare la porta per consentire l'ingresso di un tubo Tygon. In alternativa, utilizzare l'incubatrice New Brunswick G25, che contiene una porta per tubi. Non utilizzare un agitatore d'acqua all'aperto, poiché la condensa si accumulerà nei tubi tra i palloni, potendo contaminare in modo incrociato le colture. |
| Portafiltro per microanalisi | Millipore | XX1002530 | diametro 25mm, supporto in acciaio inox, n. 5 tappi in silicone perforato montati in pallone filtrante standard da 125 mL |
| Forte vuoto | Edwards | E-LAB 2 | Il " casa" Il vuoto potrebbe essere troppo debole. In alternativa, utilizzare una pompa per vuoto portatile ad alimentazione elettrica come quella elencata qui. |
| 1.000 ml | Per fungere da trappola per vuoto. | ||
| ~ 2 piedi di lunghezza del tubo a vuoto a parete pesante, diametro interno 3/8 in, diametro esterno 7/8 in | Tygon | 38TT | Due pezzi: il primo collega il vuoto alla trappola e il secondo collega la trappola al sistema di filtraggio. |
| del gas N2 ad alta pressione | Purezza del 99,999%, >1.000 psi, con regolatore e regolatore di flusso del gas | ||
| Pallone | Apertura coperta con foglio di alluminio. Uno per ogni ceppo di lievito. | ||
| autoclavati da 250 mL | Aperture ricoperte da un foglio di alluminio. Uno per ogni punto temporale più due per le trappole d'acqua. | ||
| Tappi per palloni (misura 6, due fori con diametro di 5 mm) | Sterilizzati con etanolo al 70%. Uno per ogni pallone. | ||
| Tubo di vetro, lunghezza 9 cm o 17 cm, diametro interno 2 mm, diametro esterno 5 mm | Sterilizzato con etanolo al 70%. Due tubi per ogni pallone. Mettere nei fori di ogni tappo. Vedere la Figura 1 per il posizionamento di tubi da 9 e 17 cm. | ||
| ~25 cm di lunghezza del tubo di plastica, diametro interno 5 mm | Tygon | E-3603 | Un pezzo per ogni pallone. Sterilizzato con etanolo al 70%. |
| Dischi filtranti sterili | Millipore | HAWP02500 | diametro 25 mm, 0,45 &; m dimensione dei pori, uno per ogni punto temporale |
| Cuvette sterili dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL | Per misurare OD600 (cioè la concentrazione cellulare) | ||
| perline lavate con acido | Sigma | G8772 | Conservare a 4 gradi C per cellule di lisi |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Per la purificazione della colonna di RNA |
| Tampone | Preparare aggiungendo 10 µ L di β-mercaptoetanolo per 1 mL di tampone RLT, mantenere a 4 °C. | ||
| Provette di raccolta da 2 mL | Qiagen | incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock e soluzioni di lavoro | Qiagen | 79254 | L'enzima DNasi I si presenta sotto forma di polvere liofilizzata in una fiala di vetro. Utilizzando un ago e una siringa sterili, iniettare 550 µ L di acqua priva di RNasi (fornita nel kit Qiagen) nel flaconcino. Mescolare capovolgendo delicatamente la bottiglia. Per evitare di denaturare l'enzima, non vortice. Utilizzando una pipetta, rimuovere questa soluzione madre dal flaconcino e conservare in congelatore (-20 ° C) in aliquote monouso (80 µ L ciascuno). La soluzione madre non deve essere scongelata e ricongelata. |
| Tampone RDD | Qiagen | incluso nel kit Qiagen DNase | |
| con tappo a vite da 2 mL ghiacciate | Per la lisi delle cellule durante l'estrazione dell'RNA | ||
| omogeneizzatore di microsfere | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Conservare in cella frigorifera |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | per terreni YPD liquidi |
| Estratto di lievito Bacto | BD | DF0886 | per liquido Terreno YPD |
| glucosio | Fisher | D16 | per terreni YPD liquidi |
| Provette per saggio Qubit | Thermo Fisher | Q32856 | per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici |
| Kit per il saggio Quant-iTTM dsDNA BR Thermo | Fisher | Q32853 | per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici |
| test dell'RNA Quant-iTTM | Thermo Fisher | Q32855 | per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici |
| Qubit Fluorimeter | Thermo Fisher | Q33216 | per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici |
| Sistema di elettroforesi commerciale | Bioanalyzer Agilent | 2100 | per la misurazione della qualità degli acidi nucleici |
| Sequenziatore di nuova generazione | Illumina | HiSeq 2500 | per librerie di sequenziamento |
| sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi | Wafergen | Apollo 324 | per la creazione |
| Kit di isolamento dell'mRNA PrepX PolyA | Wafergen | 400047 | per isolare l'mRNA dall'RNA totale |
| PrepX RNA SEQ per il kit di libreria Illumina | Wafergen | 400039 | per la creazione di librerie di sequenziamento specifiche per filamento dall'RNA totale |
| Splitter | di codici a barrehttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, che include il comando | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installato prima di TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installato prima di R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (versione gratuita) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Riferimenti
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J.
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Ristampe e permessi
