Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.
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Articolo metodologico
Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free
In questo articolo
Sommario
Abstract
Analisi multiplex della proteina ha mostrato sensibilità diagnostica superiore e precisione rispetto alle singole proteine. Microarrays dell'anticorpo consentono migliaia di test immunodiagnostici di micro-scala eseguite contemporaneamente su un singolo chip. Formato di dosaggio sandwich migliora la specificità dell'analisi rilevando ogni destinazione con due anticorpi, ma soffre di reattività crociata fra i reagenti, limitando così la loro capacità di multiplexing. Microarray di colocalizzazione dell'anticorpo (ACM) è stato sviluppato per la rilevazione di proteine "multiplex" cross-reactivity-gratis, ma richiede un costoso spotter in loco per la produzione di microarray durante le analisi. In questo lavoro, dimostriamo una tecnologia di chip di snap che trasferisce il reagente da microarray a DNA-microarray di schiocco semplicemente due chip insieme, che così nessun spotter è necessaria durante l'incubazione del campione e la successiva applicazione degli anticorpi di rilevamento (danti) su deposito di diapositive pre-macchiati, dissociando la preparazione del vetrino dall'esecuzione di test. Entrambi i metodi di trasferimento di singole e doppie sono presentati per ottenere l'allineamento tra i due microarray e la fabbricazione di diapositiva per entrambi i metodi sono descritti. I risultati indicano che < 40 μm allineamento è stato realizzato con doppio trasferimento, raggiungendo una densità di matrice di 625 punti/cm2. Un immunoassay 50-plexed è stato condotto per dimostrare l'utilizzabilità del chip lo snap in analisi multiplex della proteina. Limiti di rilevazione delle 35 proteine sono nella gamma di pg/mL.
Introduzione
Un pannello di biomarcatori che comprende proteine multiple può fornire maggiore sensibilità e specificità rispetto al singolo biomarcatore nella diagnosi di malattie complesse come cancri1,2. L'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è stata la tecnologia di gold standard utilizzata nei laboratori clinici, raggiungimento di un limite di rilevazione a basso pg/mL nel plasma, ma limiti a una sola destinazione per dosaggio3,4,5. Microarrays dell'anticorpo sono stati sviluppati per accogliere migliaia di sag....
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Protocollo
1. fabbricazione e deposito di scatto chip
- metodo di trasferimento singolo ( Figura 1a)
- Spot cabina soluzioni contenenti 400 µ g/mL anticorpi e glicerolo 20% in tampone fosfato salino (PBS) su una nitrocellulosa (o un bicchiere funzionalizzato) diapositiva di dosaggio con un getto di inchiostro microarray spotter 13 a un'umidità relativa del 60% (1.2 nL per ogni spot) con spaziatura di centro--centro 800 µm. Accertarsi che il vetrino sia fissato sul ponte spotter secondo un angolo (qui, nell'angolo inferiore sinistro è stato utilizzato).
- Incubare il vetrino di saggio macchiato a tempe....
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Risultati
La procedura di analisi per singolo e doppio metodi di trasferimento è mostrato nella Figura 1. Nel singolo trasferimento, le cabine sono macchiate direttamente nella diapositiva saggio e i tocchi vengono trasferiti nella diapositiva di analisi al momento dell'impiego in un modello di specchio delle carrozze (Figura 1a). Un solo trasferimento procedura è necessaria, ma questo metodo soffre di disallineamento tra i due microarray,.......
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Discussione
In questo lavoro, abbiamo presentato una tecnologia di chip di snap che rende i test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex ampiamente disponibili per i ricercatori con base messa a punto sperimentale. Diverso da microarrays dell'anticorpo esistente, nessun spotter microarray è necessaria per gli utenti finali. Sono dimostrati sia singola che doppia i metodi di trasferimento, e raddoppiare il transfer offre una precisione di allineamento superiore verso il basso per ~ 40 μm per macchie di 98%, con il più grande c.......
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Dichiarazioni
McGill University ha presentato una domanda di brevetto su alcuni aspetti di questo lavoro con Huiyan Li e David Juncker come inventori.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Rob Sladek per l'uso del cercatore a getto d'inchiostro. Riconosciamo il supporto finale da istituti canadesi per Health Research (CIHR), scienza naturale e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC), l'Istituto di ricerca di società cancri canadese e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI). D.J. grazie sostegno da un Canada Research Chair.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Compressa salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Cy5 coniugato con streptavidina | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Albumina sierica bovina | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Soluzione di bloccaggio: Stabilizzatore per microarray StabilGuard Choice senza BSA | SurModics, Inc | SG02 | |
| Vetrini rivestiti in nitrocellulosa | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Vetrini rivestiti di aminosilano | Schott North America | 1064875 | |
| Dispositivo a scatto | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Spotter di microarray a getto d'inchiostro | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Guarnizione del modulo di scorrimento | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Perle di stabilizzazione dell'umidità | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Versione 4.5 | |
| Scanner per microarray a fluorescenza | Agilent | SureScan Software per microarray Software | |
| di biostatistica | Software GraphPad | GraphPad Prism 6 | |
| Anticorpo per cattura endoglina | R& Sistemi D | MAB10972 | |
| R& R sulla proteina endoglinica | D Systems | 1097-EN | |
| Anticorpo per la rilevazione dell'endoglina | R& Sistemi D | BAF1097 | |
| IL-6a (vedi Tabella 1) | R& D Sistemi | ||
| IL-6b (vedi Tabella 1) | Invitrogen |
Riferimenti
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al.
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Ristampe e permessi
