Tecnica di costrizione aortico trasversale mininvasiva in topi per induzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere passo passo la tecnica di costrizione aortico trasversale mininvasiva (TAC) in topi. Dall'eliminazione di intubazione e la ventilazione che sono obbligatori per la procedura standard comunemente utilizzata, TAC mininvasiva semplifica la procedura operativa e riduce lo sforzo messo sull'animale.

Abstract

Restringimento aortico trasversa (TAC) in topi è una delle tecniche chirurgiche più comunemente usate per prove sperimentali di pressione indotta da sovraccarico lasciato l'ipertrofia ventricolare (LVH) e della sua evoluzione verso lo scompenso cardiaco. Nella maggior parte delle indagini segnalate, questa procedura viene eseguita con intubazione e ventilazione dell'animale che rende impegnativo e che richiede tempo e aggiunge al carico chirurgico per l'animale. L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere una tecnica semplificata di mininvasiva TAC senza intubazione e ventilazione dei topi. Al fine di raggiungere la mortalità bassa ed alta efficienza nell'induzione LVH sono dati risalto a fasi critiche della tecnica.

Topi maschii C57BL/6 (10-settimana-vecchio, 25-30 g, n = 60) sono stati anestetizzati con una singola iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina e xilazina. In una respirazione spontanea animale seguendo una sternotomia parziale superiore 3-4 mm, un segmento di sutura seta 6/0 threaded attraverso l'occhio di un aiuto di legatura era passato sotto l'arco aortico e legato sopra un ago calibro 27 smussato. Falsità-azionati gli animali hanno subito la stessa preparazione chirurgica ma senza costrizione aortica. L'efficacia della procedura nell'induzione LVH è attestata da un significativo aumento del rapporto peso cuore/corpo. Questo rapporto è ottenuto a giorni 3, 7, 14 e 28 dopo la chirurgia (n = 6-10 in ogni gruppo e ogni punto di tempo). Utilizzando la nostra tecnica, LVH è osservata in TAC rispetto agli animali di sham dal giorno 7 attraverso il giorno 28. Operativa e tardo (oltre 28 giorni) mortalità sono entrambi molto bassa all'1,7%.

In conclusione, la nostra tecnica economica di TAC mininvasiva in topi trasporta bassissima mortalità operativa e post-operatorio ed è altamente efficace nell'indurre LVH. Semplifica la procedura attiva e riduce lo sforzo messo sull'animale. Può essere facilmente eseguita seguendo i passaggi critici descritti nel presente protocollo.

Introduzione

Negli ultimi anni, lo studio dell'insufficienza cardiaca è stato condotto in modelli animali vitali¹. Rispetto ai grandi modelli animali di infarto, piccoli modelli animali presentano numerosi vantaggi potenziali. Al lato di minori costi di custodia e manutenzione, piccoli modelli animali sono accessibili ai ricercatori più dovuto il meno complesso di strutture necessarie².

Modelli murini di insufficienza cardiaca offrono molti degli stessi vantaggi come i modelli di ratto. Inoltre alloggiamento a ridotto Costa³, modelli murini beneficino dalla disponibilità di rilevanti transgenici e knockout (KO) ceppi. La possibilità di cella KO di tipo-specific, inducibile o transgeniche strategie rendono il mouse un prezioso strumento per studiare la patogenesi dell'insufficienza cardiaca e per tentare di identificare nuovi regimi terapeutici³.

Fra il mouse attualmente⁴sono utilizzati modelli di insufficienza cardiaca, restringimento aortico trasversa (TAC) che in primo luogo è stato descritto da Rockman⁵ è il modello preferito per generare pressione indotta da sovraccarico ipertrofia ventricolare sinistra (LVH)^{1 , 3}. il grande vantaggio di questo modello è la capacità di consentire la stratificazione di LVH², sebbene ventricolare sinistra rimodellamento in risposta alla TAC è variabile tra diversi ceppi di topi diversi. In particolare, i topi C57BL/6 sviluppano rapida dilatazione di LV dopo la TAC che non può verificarsi con altri ceppi^4,6,7.

L'improvvisa comparsa di ipertensione raggiunto con TAC cause un circa 50% aumento di LV massa entro 2 settimane, permettendo di esaminare rapidamente l'attività degli interventi farmacologici o molecolari allo scopo di modulare lo sviluppo di LVH⁴. L'induzione acuta di ipertensione severa di TAC non esattamente riprodurre l'ipertrofia ventricolare di sinistra progressiva e rimodellamento osservato nella regolazione clinica di stenosi aortica o ipertensione arteriosa. Tuttavia, questo modello viene utilizzato da molti ricercatori per identificare e modificare i nuovi bersagli terapeutici nell'insufficienza cardiaca⁴.

Esecuzione di TAC nei topi richiede una maggiore esperienza chirurgica di quella richiesta per altre tecniche utilizzate per indurre LVH e conseguente insufficienza cardiaca². Maggior parte degli autori per eseguire questa procedura intubating e ventilazione l'animale^2,8, che rende questa procedura più esigente e che richiede tempo e aggiunge al carico chirurgico per l'animale. Solo pochi ricercatori hanno utilizzato mininvasiva TAC nel loro studio con breve accenno alla procedura chirurgica^9,10,11.

L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere passo passo una tecnica semplificata e facile da usare di mininvasiva costrizione trasversale aortica nei topi, evidenziando le fasi critiche della procedura. Seguendo questi passaggi chiavi, uno può facilmente eseguire questa tecnica.

Protocollo

topi maschii C57BL/6J (10 settimane, 25-30g, n = 60) sono utilizzati nel presente protocollo. Gli animali ricevono un'assistenza umana in conformità con gli orientamenti formulati dal Ministero francese dell'agricoltura e dell'istruzione superiore e della ricerca, e tutte le procedure sono eseguite in conformità con la direttiva comunitaria del Consiglio, del 24 novembre 1986 ( 86/609/CEE) e le leggi francesi. Il protocollo è stato approvato dalla " regionale Comitato etico per CREMEAS di sperimentazione animale " (#2016092816207606).

1. preparazione per la chirurgia

1. mantenere i topi per una settimana dopo l'arrivo nella struttura animale su un ciclo luce/buio di 12h / 12h, in gabbie standard, con il cibo (per dettagli vedere la tabella materiali) e acqua disponibili annuncio libitum.
2. Il giorno di apertura, luogo i topi in gabbie individuali pochi minuti prima dell'induzione dell'anestesia, al fine di evitare qualsiasi ulteriore stress per l'animale. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici il giorno prima dell'intervento chirurgico.
3. Intra-peritoneally iniettare una dose singola di una miscela di ketamina (51,4 mg/kg) e xilazina (3,3 mg/kg) diluito in soluzione salina (0,9% NaCl).
4. Assicurarsi della profondità dell'anestesia per l'assenza del riflesso toe-retreat.
5. Radere il collo e il petto dell'animale con un rasoio commercialmente disponibile e disinfettare la zona rasata con alcool al 70%.
6. Metti l'animale supina su un tappetino di lavoro pulito sughero e correggere le zampe con nastro adesivo.

2. Chirurgia

1. tecnica chirurgica Sterile viene utilizzato durante le procedure. In un spontaneamente respirazione animale, eseguire un'incisione cervicale longitudinale della linea mediana superiore a 10 mm con un coltello di lama 11 dalla tacca sopra-sternal al Mid-petto al fine di esporre lo sterno ( Figura 1).
2. Ritrarre la tiroide passando una sutura in polipropilene soggiorno 4/0 monofilamento con un Crile-Wood porta aghi e con nastro adesivo al lavoro pad.
3. Separare senza mezzi termini i muscoli pre-tracheali con micro-chirurgici pinze per scoprire la trachea.
4. Slide delicatamente la punta liscia curvo forcipe micro-chirurgica con le mascelle chiuse sopra la trachea e dietro lo sterno.
5. Di apertura e chiusura le ganasce della pinza microsurgical curva con punta liscia controllare scrupolosamente una dissezione smussa sotto i muscoli pre-tracheali e dietro lo sterno ad allontanare la pleura.
6. Afferrare i muscoli proprio supra-clavicular con il forcipe dritto micro-chirurgica con punta liscia e tirare delicatamente il torace dell'animale.
7. Far scorrere la mascella inferiore della pinza dell'osso sotto lo sterno ed eseguire una sternotomia parziale superiore di 3-4 mm ( Figura 2). Dirigere la parte inferiore del mini-sternotomia leggermente verso sinistra.
8. Passare una 7/0 soggiorno in polipropilene sutura monofilamento da dentro a fuori attraverso lo spazio intercostale secondo su ogni lato del mini-sternotomia utilizzando un porta aghi micro-chirurgica. Stare vicino a angolo costo-sternale per evitare lesioni ai vasi toracici intercostali e interni o pleura.
9. Diffondere i bordi sternali con suture 7/0 monofilamento in polipropilene soggiorno su ogni lato e fissarle al rilievo del lavoro con nastro adesivo.
10. Spostare delicatamente da parte i muscoli pre-tracheali, grasso mediastinico e timo con punta liscia curvo forcipe microsurgical per visualizzare l'arco aortico sotto ingrandimento di bassa potenza (2-3x) ( Figura 3). Prestare particolare attenzione di non toccare o danneggiare la pleura parietale per prevenire lo sviluppo di pneumotorace.
11. Esporre il tessuto molle sotto l'arco aortico legando forcipe ( Figura 4 A) e diffondere delicatamente le mascelle. Preparare un tunnel nel tessuto molle sotto l'arco aortico con secondo legatura forcipe delicatamente aprendo e chiudendo le ganasce nei tessuti molli.
12. Passare un segmento della legatura seta 6/0 threaded attraverso l'occhio di un aiuto di legatura ( Figura 4 B) tenuto nella mano sinistra sotto l'arco aortico e recuperarla legando forcipe tenuto nella mano destra tra l'origine di la destra innominate e sinistra arterie carotiche comuni ( Figura 5).
13. Tagliare un ago calibro 27 ad una lunghezza di 5 mm e smussato entrambe le estremità da li premendo con un porta-aghi Crile. Posizionare l'ago calibro 27 blunted accanto all'arco aortico ( Figura 6) con il forcipe dritto micro-chirurgica con punta liscia e legare la sutura attorno l'ago e l'aorta tra la carotide comune destra innominate e sinistra arterie utilizzando le due pinze di legature ( Figura 7). Per legare saldamente la sutura, eseguire un doppio nodo iniziale seguito da quattro nodi aggiuntivi. Assicurarsi che tutti i nodi siano piani.
14. Dopo la legatura, rimuovere velocemente ma delicatamente l'ago per raggiungere un restringimento del diametro di 0,4 mm e un restringimento aortico riproducibile trasversale 65-70%.
15. Verifica per accertare l'emostasi dei tessuti molli attorno all'arco aortico, dei bordi sternali e muscoli pre-tracheali. Mettere garza emostatico riassorbibile dove lo stillicidio dell'anima è osservato. Rimuovi il polipropilene monofilamento 7/0 soggiornare suture usate per spalmare i bordi sternali.
16. Passare una semplice sutura in polipropilene monofilamento 6/0 con un porta-aghi micro-chirurgica da fuori a dentro lo spazio secondo intercostale sinistro e poi da dentro a fuori dello spazio intercostale di destra secondo. Stare vicino a angolo costo-sternale per evitare lesioni ai vasi toracici intercostali e interni o pleura.
17. Portare insieme i bordi dello sterno legando il filo di sutura in polipropilene monofilamento 6/0 con un Crile-Wood porta aghi.
18. Chiudere la pelle con un polipropilene 5/0 monofilamento sutura in esecuzione in un unico strato con un Crile-Wood porta aghi.
19. Eseguire la procedura sham identica per l'operazione di costrizione, ma senza vincolare una sutura intorno all'aorta.

3. Recupero post-operatorio

1. monitorare molto da vicino gli animali. trasferire il mouse a una gabbia individuale e collocarlo in posizione prona.
2. Consenti il mouse per recuperare sotto una luce riscaldamento fino a quando completamente svegli (meno di 1 h dopo l'induzione di anestesia).
3. Per l'analgesia post-operatoria, iniettare 0,1 mg/kg di buprenorfina intraperitonealmente. Ripetere le iniezioni sottocutanee di 0,1 mg/kg di buprenorfina ogni 8 h per i primi tre giorni, come indicato.
4. Posto i topi azionati in gabbie standard (massimi 3 topi per gabbia) e minimi 2 topi per gabbia.

4. Vendemmia del cuore

1. il giorno delle analisi, eutanasia il mouse con una soluzione di ketamina 300 mg/kg e xilazina 20 mg/kg in soluzione salina tramite l'iniezione intraperitoneale.
2. Prima della raccolta del sangue dalla vena cava inferiore e poi attraverso la stessa linea iniettare 5 mL di soluzione di 2,6 mM EDTA in soluzione salina.
3. Il cuore della raccolta, rimuovere gli atrii e peso del cuore (ventricoli destro e sinistro senza atria).
4. Separare sinistra dal giusto ventrICLE con setto restanti per la parte del ventricolo sinistro. Pesare entrambi campioni di tessuto e congelarli in azoto liquido.

Risultati

Operativa e tardiva sopravvivenza
La sopravvivenza operativa era molto alta, 98,3% (59 su 60) per l'intera serie (TAC e animali falsità-azionati). La morte solo attiva era a causa di una complicazione di spurgo in un mouse piallato per operazione finta. Sopravvivenza post-operatorio durante il periodo di osservazione di 28 giorni era anche eccellente, da 98,3% (58/59). La morte postoperatoria soltanto in ritardo si è verificato in un mouse TAC giorno (D) 16, possibilme...

Discussione

L'obiettivo di questo protocollo è di presentare un'illustrazione passo passo della tecnica chirurgica per mininvasiva trasversale aortica costrizione in topi. Descrizione tecnica dettagliata di costrizione trasversale aortica nei topi è stato segnalato da altri autori^2,8. Tuttavia, questi ricercatori eseguono un intervento chirurgico dopo l'intubazione e la ventilazione degli animali. L'uso di un ulteriore passaggio di intubazione-ventilazione aumenta la comples...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio operatorio	Olympus	SZX2-TR30
Rasoio	Rowenta	Nomad TN3650FO
Suture:
Polipropilene 7/0	Ethicon	BV-1X
Polipropilene 6/0	BBraun	C0862061
Seta 6/0 legatura	FST	18020-60
Polipropilene 4/0	Ethicon	8683
Polipropilene 5/0	Ethicon	Z303
Farmaci:
Ketamina	Merial	Imalg... ne 1000, LBM154AD
Xilazina	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorfina	Ceva	Vetergesic, 072013
Instruments:
Tronchesi ossei	Strumenti chirurgici fini	16101-10
Ausilio per la legatura	Strumenti chirurgici fini	18062-12
Pinze per legatura	Strumenti chirurgici fini	18026-10
Porta aghi Strumenti chirurgici fini in legno Crile		12003-15
Pinze per microchirurgia	Strumenti chirurgici di precisione	11003-12
Pinze per microchirurgia	Strumenti chirurgici di precisione	11002-12
Pinze per tessuti	Strumenti chirurgici di precisione	11021-12
Porta aghi per microchirurgia	Strumenti chirurgici di precisione	12076-12
Forbici per microchirurgia	Strumenti chirurgici di precisione	91501-09
Forbici Mayo	Strumenti chirurgici di precisione	14511-15
Coltello a 11 lame	Chirurgia fine Strumenti	10011-00
Estrazione dell'RNA e qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit Saggio fluorimetrico dell'RNA	Fisher Scientific	10034622
kit RNA 6000 Nano	Agilent	5067-1511
Kit cDNA ad alta capacità	Fisher	Scientific 10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Taqman Primer BNP	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP primer	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Primer Taqman ACE Fisher	Scientific	Mm00802048_m1
Primer Taqman Col1a1	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb primer	Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh primer	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler	Applied Biosystems	7000
Software:
GraphPad Prism GraphPad		Prism 7
Cibo per animali
Dieta completa per ratti/topi adulti		Safe UB220610R