Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Summary

Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Abstract

Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell'esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell'esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un 'sezione-holding loop' e evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.

Introduction

Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell'elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione^{1,2,3, 4,5}. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola 'structome' combinando 'struttura' e '-ome' e l'ha defin....

Protocol

Nota: I campioni utilizzati in questo studio sono stati microrganismi, rapidamente congelati con propano in azoto liquido, congelare sostituiti in acetone contenente 2% tetrossido di osmio e incorporati in resina epossidica resina^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,}

Results

In questo protocollo, tre-fessura griglie sono stati utilizzati per raccogliere le sezioni di serie. Le griglie sono costituite di nichel o rame. Le sezioni di serie vengono inserite nella fessura centrale. Le fessure su entrambi i lati sono necessari per visualizzare le sezioni quando raccoglierli con la griglia. Per mantenere le griglie parallele con le sezioni di serie quando li raccogliendo con le pinzette (Figura 11d), la maniglia è piegata (

Discussion

Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regola.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apparecchio per la produzione di Formvar	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	652	L 180 x P 180 x H 300 mm
Vetrino	Matsunami Co. Ltd.,	Osaka-76	x 26 x 1,3 mm
Rack in alluminio con fori da 4 mm	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	658	L 30 x P 25 x H 3 mm, Fare riferimento a questo documento
Stereomicroscopio	Nikon Co. Ltd.,		Tokyo-SMZ 645
Illuminazione a LED per stereomicroscopio	Nikon Co. Ltd.,		Tokyo-SM-LW 61 Ji
Tavolino di rifilatura	Sunmag Co.Ltd.,	Tokyo-Meccanismo	di inclinazione attrezzato, Fare riferimento a questo documento
Illuminazione a LED per il tavolino di rifilatura	Sunmag Co.Ltd.,	Tokyo-Fare	riferimento a questo documento
Lama di rifilatura ad ultrasuoni	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, fare riferimento a questo documento
Coltello diamantato per la rifilatura	Diatome Co. Ltd.,	Svizzera-45	°
Coltello diamantato per sezionamento ultrasottile	Diatome Co. Ltd.,	Svizzera-45	°
Ultramicrotomo	Leica Microsystems,		Vienna-Ultracut S
Taglio Mesa	Leica Microsystems, Vienna-Mirror
0,5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Griglia speciale in nichel a 3 fessure	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2458	Fare riferimento a questo documento
Griglia speciale in rame a 3 fessure	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2459	Fare riferimento a questo documento
Anello di tenuta della sezione	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	526	Fare riferimento a questo documento
Anello di sollevamento della superficie dell'acqua	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	527	Fare riferimento a questo documento
Tubo di colorazione	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Fare riferimento a questo documento
Supporto multi-campione	JEOL Co. Ltd.,		Tokyo-EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd.,	Tokyo-Microscopio	elettronico a trasmissione