Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Sommario

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} e Ca^{2 +}- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Abstract

La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico^{2 +} buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca^{2 +} concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA^{2 +} può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca^{2 +} conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA^{2 +}-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca^{2 +} vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca^{2 +}-relative funzioni mitocondriali.

Introduzione

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca^{2 +} dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP¹. Quando la concentrazione di Ca citosolico^{2 +} supera una soglia, i mitocondri possono l'assorbimento di Ca^{2 +} rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l'aumento citosolico Ca^{2 +}. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca^{2 +} anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l'apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana². È stato ampiamente riconosciuto che l'elevazione anormale del intracellulare di Ca^{2 +} può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP³. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale.

Capacità di ritenzione di CA^{2 +} è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall'assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca^{2 +} si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie^4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} , e l'elevata capacità di accumulare Ca^{2 +} di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura⁶. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde, Ca^{2 +}-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato⁷. CA^{2 +}-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca^{2 +} le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)⁸. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca^{2 +} eleva fluorescenza verde di calcio e l'assorbimento di Ca^{2 +} dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca^{2 + 9}, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca^{2 +} . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.

Dopo Ca^{2 +} accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca^{2 +} nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA^{2 +}-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca^{2 +}-innescato mitocondriale gonfiore^10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce¹², dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.

Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.

Protocollo

1. isolamento dei mitocondri

Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 - 4 ° C e tenute su ghiaccio.

1. Seme circa 3 x 10⁶ SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO₂ durante la notte.
   Nota: almeno 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y cellule sono necessari per ciascun test di isolamento.
2. Rimuovere il supporto e lavare le cellule con circa 1 mL di PBS freddo di ghiaccio in una piastra di coltura cellulare di 10cm 3 volte.
3. Aggiungere nuovo 1 mL di PBS freddo ghiaccio nella piastra di coltura cellulare di 10cm e raschiare le celle aderenti in una nuova provetta da 1,5 mL. Centrifuga a 800 x g per 10 min a 4 ° C.
4. Durante la centrifugazione, preparare il tampone di isolamento mitocondriale di 5 mL (250 mM saccarosio, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina ethanesulfonic acido), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) completato con 50 µ l di brodo di inibitori di proteasi soluzione (una concentrazione di 100 x; 1 compressa EDTA-libero dissolto in 500 µ l di ddH₂O).
5. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale. Incubare la provetta da 1,5 mL in ghiaccio per 30 min.
6. Lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro (15-25 colpi) su e giù manualmente sul ghiaccio.
   Nota: Assicurarsi che non ci sono bolle quando le cellule sono omogeneizzate. Contare le cellule intatte e nuclei scoperti da microscopio visivamente e confermare che > rottura cellulare 90% si è verificato.
7. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere i detriti (nuclei e restanti cellule intatte).
8. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min 4 ° C.
9. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 14.000 x g per 15 min 4 ° C.
10. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale.
11. Centrifugare la soluzione per 15 min a 4 ° C di 14.000 x g per precipitare i mitocondri.
12. Il pellet di mitocondri risultante deve essere tenuto sul ghiaccio e risospesi in 50-100 media KCl μL (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1mm MgCl₂, 20mm HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM e 2 rotenone μM, pH 7.4) secondo il volume di pellet prima qualsiasi culo Ay.
13. Utilizzare 5 μL di soluzione di mitocondriale per misurare la concentrazione di proteina mitocondriale di test standard di BCA, OD562 di misura utilizzando un lettore di piastra¹³.

2. la determinazione della capacità di ritenzione di mitocondriale di Ca^{2 +}

1. Preparare il supporto di KCl e aggiungere il Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde a una concentrazione finale di 0,5 μM prima dell'esperimento.
2. Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl che contengono 0,5 μM Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde in ogni piastra a 6 pozzetti bene.
3. Incubare i mitocondri e il Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde nel piatto 6 pozzetti a temperatura ambiente al riparo dalla luce ambiente per 1 min. aggiungere 4 aliquote del μL di un soluzione di CaCl₂ (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ da 20 mM 20 mM HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM, pH 7.4) per ogni piastra a 6 pozzetti pozzetto usando l'automatico dispensa impostazione di introdurre 200 nmol proteina mitocondriale di Ca^{2 +}/mg.
4. Utilizzare uno spettrometro di fluorescenza per monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nm. La piastra è dotata di agitazione a 600 rpm per 3 s tra letture controllato dal software (Figura 1).
5. Aggiungere un'aliquota di ulteriori 4 μL di soluzione di 20 mM CaCl₂ in ciascun pozzetto e monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min. Ripetere questo passaggio finché la fluorescenza aumenta con il tempo.
   Nota: I mitocondri sono sfidati con l'aggiunto Ca^{2 +} indicato dalla registrazione maggiore fluorescenza. Quando si apre il mPTP, la fluorescenza aumenta con il tempo.
6. Interpretare la quantità totale di Ca^{2 +} aggiunte fino a quando il mPTP apre come la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} .

3. determinazione del Ca ^{2 +}-indotto gonfiamento mitocondriale

1. Preparare il supporto di KCl prima dell'esperimento.
   1. Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl in ogni piastra a 6 pozzetti bene.
2. Aggiungere 10 μL di 20 mM CaCl₂ soluzione acquosa (500 nmol/mg di proteina mitocondriale) nella proteina mitocondriale di innescare gonfiamento mitocondriale.
3. Registrare la diminuzione di assorbanza a 540 nm ogni 3 s su un lettore di micropiastre controllato dal software per 10 min (Figura 2). Le modifiche di fluorescenza sono causate da un afflusso di soluti attraverso la membrana mitocondriale interna.
   Nota: La diminuzione assorbanza a 540 nm corrisponde ai mitocondri gonfiati. Se il lettore non ha rispettato una diminuzione di assorbanza, un più lungo intervallo di lettura o di tempo di lettura può essere adottato.

Risultati

Rappresentante risultati di Ca^{2 +} capacità di ritenzione:
Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca^{2 +} (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l'apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca^{2 +}-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca^{2 +}-indotto mPTP apertura, sono stati a...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca^{2 +} ritenzione capacità dosaggio e Ca^{2 +}-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.

Per l'isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana delle ce...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare SH-SY5Y	ATCC (The Global Bioresource Center)	Numero ATCC: CRL-2266
Verde di calcio-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-legante colorante fluorescente verde
inibitori completi della proteasi Roche	Molecular Biochemicals	4693116001
omogeneizzatore di vetro	Kimble Chase	9885303002
glutammato	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malato	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Strumenti flash Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco' ad alto contenuto di glucosio s Hyclone medio Eagle modificato		SH30022	4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, senza piruvato di sodio
siero fetale bovino	Hyclone SV30087
penicillina	Sigma-Aldrich	P3032
streptomicina	Invitrogen	11860-038
Kit di test BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
piatto per coltura cellulare da 10 cm	NEST	704001