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Articolo metodologico

Utilizzo di Laser Doppler Imaging e monitoraggio per analizzare il microcircolo del midollo spinale nel ratto

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DOI:

10.3791/56243

⸱

30 maggio 2018

 ,  ,  , 
1China Rehabilitation Research Center, 2Institute of Rehabilitation Science of China, 3Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders, 4Beijing Key Laboratory of Neural Injury and Rehabilitation

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo una combinazione della perfusione Doppler laser imaging (LDPI) e monitoraggio di laser Doppler aspersione (LDPM) per misurare spinale cord flussi sanguigni locali e saturazione dell'ossigeno (SO2), così come una procedura standardizzata per l'introduzione del midollo spinale trauma da ratto.

Abstract

Flussometria del laser Doppler (LDF) è un metodo non invasivo per la misura di portata (BF) di sangue, che lo rende preferibile per la misurazione microcircolatorie alterazioni del midollo spinale. In questo articolo, il nostro obiettivo era di utilizzare sia Laser Doppler imaging e monitoraggio per analizzare il cambiamento di BF dopo la ferita del midollo spinale. Sia il laser scanner di immagini Doppler e il sonda/monitor sono stati impiegati per ottenere ogni lettura. I dati di LDPI fornito una distribuzione locale di BF, che ha dato una panoramica di aspersione intorno al sito di lesione e reso accessibile per l'analisi comparativa di BF tra posizioni diverse. Intensamente misurando l'area sondaggio per un periodo di tempo, una sonda combinata è stata utilizzata per misurare simultaneamente la saturazione di ossigeno e BF del midollo spinale, mostrando perfusione generale del midollo spinale e rifornimento di ossigeno. LDF stessa ha alcune limitazioni, quali flusso relativo, segnale di sensibilità al movimento e zero biologico. Tuttavia, la tecnologia è stata applicata in studio clinico e sperimentale, grazie alla sua semplice installazione e misura rapida di BF.

Introduzione

Il tessuto del midollo spinale è estremamente sensibile all'ipossia indotta da lesione del midollo spinale (SCI) e altamente vascularized. Nostri studi precedenti hanno mostrato che il flusso di sangue del midollo spinale è stato diminuito significativamente dopo trauma cranico lesioni1,2, che potrebbe essere collegato al deficit della funzione motoria. Recenti studi hanno dimostrato che l'integrità dei vasi sanguigni dopo SCI è ben correlato con il miglioramento della funzione motoria sensoriale3. È stato segnalato che una migliore vascolarizzazione potrebbe salvare la materia bianca, che indirettamente conduce a miglioramento della funzione4. Di conseguenza, il mantenimento della perfusione di alberino-ferita del midollo spinale è sembrato essere di primaria importanza per preservare la vitalità e funzionalità.

Gli effetti dei vari trattamenti su aspersione dopo SCI sono stati esaminati da numerosi ricercatori usando una varietà di tecniche in modelli sperimentali di SCI5,6,7. Laser Doppler, come una tecnica ben consolidata, era senza dubbio un metodo utile per la quantificazione di aspersione in parecchi studi animali ed umani8,9,10,11. La tecnica si basa sulla misurazione l' effetto Doppler12 indotta da globuli rossi in movimento alla luce illuminante. Dalla commercializzazione della tecnica nei primi anni 1980, grandi progressi compiuti nella tecnologia laser, fibre ottiche ed elaborazione dei segnali per aspersione di misurazione laser Doppler strumenti13, che ha reso LDF in una tecnologia affidabile.

Nello studio corrente, entrambi i metodi del laser Doppler misura sono stati applicati per valutare il flusso sanguigno (BF) nei midolli spinali dei ratti concussive. A causa della natura non invadente della tecnologia e sua installazione semplice, il nostro protocollo fornisce un metodo sensibile, rapido e affidabile per misure di BF del midollo spinale. Ancora più importante, questo metodo consente uno studio longitudinale di BF post concussiva SCI senza sacrificio animale in ogni momento.

Grazie alla capacità di valutare il BF del tessuto e veloci cambi di aspersione durante la stimolazione, è possibile applicare questo protocollo per valutare cerebrale BF14,15 , nonché di misurare altri tessuti quali fegato16, 17, pelle18,19e viscere20. In un modello del ratto dell'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale centrale, le letture di Doppler del laser sono state utilizzate per assicurare la corretta riduzione del tasso di BF a livelli che sono attesi nella penombra ischemica14. In ratti che sono stati sottoposti a induzione (CLI) l'ischemia critica degli arti, scansione Doppler laser è stata applicata per osservare dell'arto BF prima e dopo la procedura CLI e durante diversi periodi dopo trattamento21. Inoltre, la biodisponibilità e la clearance metabolica di alcuni farmaci dipendeva dal BF epatica, che è stato rilevato da LDF16. Di conseguenza, LDF potrebbe essere ampiamente usato nella valutazione del modello sperimentale, di farmacodinamica e farmacocinetica.

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Protocollo

Protocolli degli animali che coinvolgono gli animali sperimentali seguivano linee guida stabilite dai National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Capital Medical University.

Le procedure di introduzione di SCI e di misurazione BF del midollo spinale utilizzando laser Doppler apparecchiature descritte di seguito sono state utilizzate in un studio pubblicato1.

1. preparazione per la chirurgia

  1. Preparare il sodio pentobarbital soluzione 3% (p/v) in soluzione salina e amministrare alla dose di 35 mg/kg.
    Attenzione: il sodio pentobarbital è una sostanza controllata. Dovrebbero essere tenuti registri dettagliati e soluzioni archiviate in un luogo sicuro, bloccato.
  2. Sterilizzare attrezzature e preparare l'area operata.
    1. Pulire l'attrezzatura di chirurgia con le seguenti operazioni: pulizia, quindi sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 30 min, poi asciugare in forno a 60 ° C durante la notte di etanolo di 75%. Sterilizzare la zona di chirurgia con 75% di alcol.

2. preparazione del ratto per chirurgia

  1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (35 mg/kg). L'intera procedura dovrebbe prendere 30-40 min tra cui chirurgia, misure di BF e suture.
  2. Radere la zona dorsale del ratto dalla parte bassa della schiena fino al collo. I capelli devono essere tagliati più corti possibile. Posizionare il topo su un 40 ° C riscaldamento pad per mantenere una temperatura corporea costante.

3. laminectomy e la commozione cerebrale al midollo spinale

Nota: Per eseguire il laminectomy solo per gruppo finto, seguire i passaggi da 3.1 a 3.6.

  1. Posizionare il lato dorsale animale fino. Sterilizzare la parte rasata con iodio seguito da 75% di alcol utilizzando batuffoli di cotone sterile. Fare un'incisione della pelle (4 cm) con il bisturi sopra il sito di laminectomia coprendo vertebre toraciche T7 a T11.
  2. Tagliare i muscoli collegati su entrambi i lati da T8 a T10 per esporre i processi spinous, lamine e giunti di sfaccettatura.
  3. Utilizzare il bisturi per effettuare incisioni che scollegare la giunzione tra T10 e T11. Inoltre espone la giunzione di attentamente dissecando lo strato del muscolo via per esporre l'osso.
  4. Utilizzare le forbici per cancellare ulteriori muscolo dalla lamina e dintorni il pedicle con piccola furbetta. Questo aprirà un piccolo spazio tra le vertebre a T10 e T11 (Figura 1A). Lentamente e delicatamente inserire una pinza emostatica in questa lacuna e rompere il pedicle (Figura 1B). Assicurarsi che la curvatura delle pinze è sempre posizionata lateralmente, rispetto al cavo. Ripetere sull'altro lato.
  5. Esporre il midollo spinale (Figura 1) e sollevare con cautela e rompere la lamina. Essere sicuri di non lasciare eventuali frammenti di osso libero o frastagliati.
  6. Ripetere il processo per rimuovere ulteriori lamine T9 e T8.
  7. Spostare l'animale alla tabella attrezzature impactor e utilizzare la coppia di Adson da associata alla tabella per stabilizzare la colonna vertebrale dell'animale di bloccaggio sul processo spinous di T7 e T11, quindi regolare il forcipe per raddrizzare la spina dorsale (Figura 1).
  8. Mettere l'animale sotto il dispositivo d'urto, mirare l'asta di sciopero al centro del midollo spinale esposto e abbassare l'asta entro 3-5 mm della superficie del midollo spinale.
  9. Impostare i parametri di impatto come la forza di impatto (160 KD) e tempo di sosta (1 s)
    1. Indurre la SCI facendo clic sul pulsante "Avvia esperimento" sul software di interfaccia, quindi fare clic su "Sì" sull'interfaccia seguente per avviare automaticamente l'impatto. Dopo l'impatto, il software Visualizza i dati effettivi dell'impatto accanto a seconda dei parametri impostati, controllare i dati per assicurarsi che era vicino al punto di impostazione (Figura 1E).
      Nota: Un segno tipico per il successo dell'esperimento è stato un breve periodo di movimento di oscillazione e arto involontari coda dopo l'impatto. Potrebbero essere fatto anche stimoli alla coda per verificare la riflessione degli arti. Tuttavia, valutazione dell'apparato locomotore quali il Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) locomotore scala22,23 è necessario determinare l'efficacia della lesione indotta.

4. laser Doppler scansione

  1. Vedi la Tabella materiali per i dettagli dello scanner laser Doppler utilizzate in questo studio. Per eseguire la scansione del midollo esposto, posto sul lato dorsale del ratto su uno sfondo nero, antiriflesso.
  2. Impostare i parametri di scansione: Aprire il software di scansione, fare clic su "Misura" per accedere all'interfaccia di utente grafica misura e fare clic sul pulsante "Impostazione Scanner" per aprire l'interfaccia di installazione dello scanner. Per la scansione di piccole aree come in questo esperimento, selezionare "Alta risoluzione" sotto "Scansione dimensioni e opzioni di visualizzazione" per una modalità di scansione bene con risoluzione superiore (256 × 256 punti che copre 4 × 10 cm2) (Figura 2A). Fare clic sull'opzione "Image Scan" per controllare i perimetri di scansione (Figura 2B).
  3. Fare clic sull'opzione "Video e distanza" per verificare l'immagine video in diretta. Posizionare lo scanner 10-13 cm sopra la finestra chirurgica e spostare lo sfondo con l'animale al centro del midollo esposto sulla finestra di scansione (Figura 2).
  4. Utilizzare la funzione "auto distante" per regolare l'altezza di scansione bene, si noti che l'altezza di scansione deve essere coerenza tra tutte le misurazioni nell'esperimento Figura 2.
  5. Utilizzare una copertura antiriflesso con una finestra per esporre solo l'area chirurgica per ulteriormente ridurre sfondo e contrassegnare la direzione dell'animale.
  6. Fare clic su "Ripeti scansione", impostare il numero di scansioni (usiamo 8 scansioni di ripetere in questo caso), quindi fare clic su "OK" per aprire l'interfaccia di esplorazione di ripetizione. Fare clic sul pulsante start per avviare la scansione e l'intero processo richiederà circa 3-4 min (Figura 2D).

5. laser Doppler monitoraggio

  1. Abbiamo usato un monitor scanner con VP3 smussato della sonda ad ago fine consegna al monitor BF e SO2 nel corso del tempo. Collegare la sonda Laser Doppler perpendicolare ad uno strumento stereotassica per impostare le apparecchiature di monitoraggio.
  2. Mettere il ratto sul lato dorsale apparato stereotassica, sottoposto l'animale con un piccolo pezzo di polistirolo quando necessario livellare il midollo spinale esposto.
  3. Abbassare la sonda al midollo spinale a monitor BF.
    Nota: Passaggio 5.3 è cruciale per la riproducibilità della misurazione come le letture di dati sono sensibili alla pressione applicata alla sonda, quindi prestare particolare attenzione è necessaria per non sopra - o sotto - position la sonda.
    1. Esaminare l'incisione e rimuovere qualsiasi liquido in eccesso o sangue usando un tampone di cotone sterile.
    2. Utilizzare assi X e Y di apparato per individuare la sonda a 2 mm rostrale al punto centrale del midollo spinale esposto o lesione punto ed evitare la vena centrale.
    3. Utilizzare l'asse Z per abbassare lentamente la sonda al livello appena toccare la superficie del midollo spinale. La sonda deve solo toccare la superficie del midollo spinale ma non così sciolto per consentire qualsiasi luce brillante sfuggire dal lato del punto di contatto.
  4. Registrazione dei dati
    1. Aprire il software di acquisizione dati, fare clic sul pulsante "nuovo esperimento" per aprire l'interfaccia di installazione. Sotto l'opzione "Generale" controllare per la configurazione di sistema e fare clic su "Avanti" (Figura 3A), nell'impostazione di visualizzazione selezionare il canale per BF e SO2 e fare clic su "Avanti" (Figura 3B).
    2. Informazioni sui file di input e fare clic su "Avanti" (Figura 3) per accedere all'interfaccia di registrazione dei dati, fare clic sul pulsante triangolo verde per avviare la registrazione dei dati dalla sonda (Figura 3D).
    3. Una volta che il segnale è stabili, record dati per 8 min consecutivi. Quindi sollevare la sonda e rimuovere l'animale dall'apparecchio stereotassica a suturare l'incisione e mettere l'animale in cura post-operatoria.

6. suture e post-operatorio

  1. Suturare l'incisione: inserire un ago di sutura il muscolo su entrambi i lati dell'incisione. Tirare il filo attraverso, tirando i tessuti insieme, coprendo quindi il midollo spinale esposto presso il sito di lamine rimossi. Utilizzando il porta-aghi, tirare il filo intero, attraverso il modulo di tre nodi quadrati e tagliare il filo come vicino i nodi come possibili.
  2. Suturare la pelle con 3-4 nodi quadrati nello stesso modo come sutura l'incisione, quindi tagliare i fili circa 1 cm dai nodi.
  3. Posizionare il topo su un lato nella sua gabbia, evitando il contatto tra il sito di chirurgia e il fondo della gabbia. Gabbie dovrebbero essere posizionate su rilievi di riscaldamento.
  4. Monitorare l'animale fino a quando si sveglia dall'anestesia affinché nessun sanguinamento post-operatorio e che le suture rimangono chiuse.
  5. Iniettare per via sottocutanea benzil penicillina sodica nel ratto per 3 giorni dopo la chirurgia, 120 mg/kg al giorno. Iniettare per via intraperitoneale buprenorfina (0,05 mg/kg) immediatamente dopo la chirurgia e ogni 6 ore dopo l'intervento per 1 giorno.
  6. Per assicurarsi che gli animali hanno accesso a cibo e acqua sufficienti, bottiglie d'acqua con beccucci estese in forma e mettere il cibo vicino l'animale nella gabbia.
    Nota: Abbiamo condotto scala di rating BBB per valutare la funzione locomotoria hindlimb della post-ferita animale 24h per escludere gli animali con un punteggio di BBB superiore a 0, quindi garantendo che l'animale è stato paralizzato dalla ferita indotta.
  7. Post-chirurgia, fornire vuoto manuale della vescica urinaria applicando delicatamente pressione sull'addome, due volte al giorno, se necessario.

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Risultati

LDPI fu utilizzato per misurare il BF nel midollo spinale, che è stato quantificato lungo l'asse rostro-caudale del midollo spinale tramite l'estrazione di profili lineari (Figura 4). Figura 5A e 5B figura rappresentano rispettivamente l'imaging di flusso del midollo spinale del gruppo SCI e del gruppo finto. Figura 5 e Figura 5 rappresentan...

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Discussione

Alcuni dettagli dovrebbero essere notati durante l'esecuzione di questo protocollo. In primo luogo, il processo di anestesia e chirurgia dovrebbe essere effettuato in modo più rapido ed elegantemente possibile per ridurre al minimo lo stress introdotto all'animale. Per ridurre il disturbo ai risultati, è possibile mantenere l'animale in uno stato relativamente tranquillo e stabile. In secondo luogo, si dovrebbe prestare attenzione più al sanguinamento durante la misurazione utilizzando apparecchiature Doppler laser, poic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Laser Doppler Line ScannerMoor InstrumentsmoorLDLS2
Laser Doppler MonitorMoor InstrumentsmoorVMS-LDF
Sonda per monitorMoor InstrumentsVP3Sonda di erogazione dell'estremità dell'ago smussato
ImpactorPrecision Systems and InstrumentationIH-0400
Fenobarbital sodicoSigma-AldrichP3761
BuprenorfinaSigma-AldrichB-908
SiringaBecton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd300841
Aghi per sutura chirurgica con filoShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd18T0329 (numero di lotto) /4-0
Fabbrica di strumenti per l'operazione del bisturi di Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J11030 4 #
Lama BisturiStrumento di Funzionamento fabbrica di Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J12130 20 #
Pinza oftalmicaStrumento operativo fabbrica di Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.JD1040
Pinze emostaticheFabbrica di strumenti operativi di Shanghai Medical Instrument Co., Ltd.J31050
Benzyl penicilllina sodiumNorth China Pharmaceutical Co., LtdF6072116 (numero di lotto)
75% di alcolDezhou Anjie Gaoke prodotti per la disinfezione Co., Ltd150421R (numero di lotto)
IodineShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd20170102 (numero di lotto)
RatLaboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical SciencesSprague-Dawly (ceppo di ratto)

Riferimenti

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