Articolo metodologico

Live-imaging della migrazione delle cellule epiteliali della mammella dopo lo svuotamento transitorio di TIP60

DOI:

10.3791/56248

⸱

7 dicembre 2017

 ,  ,  , 
1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare in un'analisi di guarigione usando cellule epiteliali MCF10A TIP60-vuotati del seno. L'implementazione di tecniche di imaging di cellule vive nel nostro protocollo permette di analizzare e visualizzare la cella singola movimento in tempo reale e attraverso il tempo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il dosaggio di cicatrizzazione è efficiente e uno dei modi più economici per lo studio di migrazione delle cellule in vitro. Convenzionalmente, immagini sono prese all'inizio e alla fine di un esperimento usando un microscopio a contrasto di fase, e le capacità di migrazione delle cellule vengono valutate tramite la chiusura delle ferite. Tuttavia, il movimento cellulare è un fenomeno dinamico, e un metodo convenzionale non consente per il tracciamento del movimento di cella singola. Per migliorare l'attuale saggi di guarigione delle ferite, utilizziamo tecniche di imaging di cellule vive per monitorare la migrazione cellulare in tempo reale. Questo metodo permette di determinare il tasso di migrazione delle cellule basato su una sistema di tracciamento di cella e fornisce una più chiara distinzione tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule. Qui, noi dimostrare l'uso di formazione immagine di cellule vive in saggi di guarigione per studiare le abilità differenti migrazione delle cellule epiteliali della mammella, influenzate dalla presenza di TIP60. Motilità cellulare è altamente dinamica, il nostro metodo fornisce ulteriori approfondimenti i processi di guarigione rispetto ad un'istantanea della chiusura della ferita scattata con le tecniche di imaging tradizionale utilizzate per le analisi di cicatrizzazione della ferita.

Introduzione

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Proteina HIV-Tat-interattiva 60 kDa (TIP60) è un acetiltransferasi di lisina che possono acetilano sia degli istoni e proteine non istoniche1,2. Le sue funzioni si trovano ad per avere implicazioni in molteplici vie di segnalazione, compreso trascrizione, riparazione di danni al DNA e apoptosi1,3,4,5,6, 7 , 8. Inoltre, TIP60 è spesso downregulated nei cancri e suo downregulation è correlata con la metastasi del cancro e scarsa sopravvivenza prezzo9,10,11,12, 13,14. Metastasi del tumore è la causa principale della morte cancro-relativa. È un processo multi-step, e il passo iniziale della metastasi coinvolge la migrazione e l'invasione delle cellule del tumore nei tessuti adiacenti15,16. Al fine di farlo, le cellule del tumore in primo luogo necessario disconnettere dalla massa del tumore primario, sia nella forma di un foglio di cella collettivamente invasori o come staccato celluli17. Durante questo processo, le cellule tumorali subiscono spesso epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), con conseguente cambiamenti nella morfologia e cellula adesione capacità17,18.

Alcune tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione e la capacità di invasione del tumore le cellule in vitro. Tra di loro, il dosaggio di cicatrizzazione è più efficiente ed economico19. In primo luogo, questo metodo prevede la creazione di uno spazio artificiale su un monostrato confluente di cellule, così permettendo che le cellule di migrare e colmare il divario. In secondo luogo, le immagini delle lacune possono essere catturati all'inizio e alla fine dell'esperimento. Infine, un confronto di chiusura gap viene utilizzato per determinare il tasso di migrazione cellulare. Un microscopio a contrasto di fase è solitamente usato per catturare immagini per saggi convenzionali di cicatrizzazione. Un altro vantaggio del dosaggio cicatrizzazione è che assomiglia in parte in vivo migrazione delle cellule tumorali. Allo stesso modo in vivo metastasi tumorali, migrazione cellulare in saggi di guarigione viene illustrato sia la migrazione collettiva di fogli epiteliale e la migrazione di singole cellule indipendente.

Tuttavia, migrazione delle cellule è conosciuta per essere dinamico e c'è un bisogno di documentare il movimento delle cellule in tempo reale. Per esempio, un test convenzionali di guarigione non consente un ricercatore analizzare il movimento di cella singola. D'altra parte, cellule coltivate per i test di guarigione sono spesso siero-affamate di inibire la proliferazione delle cellule. Questo viene fatto per escludere la possibilità di chiusura gap a causa di proliferazione delle cellule. Comunque, ci sarà ancora qualche proliferazione e morte cellulare e contrasto di fase immagini scattate prima e dopo l'esperimento sono in grado di distinguere tra di loro.

La tecnica di imaging di vivere-cella risolve questa limitazione di saggi convenzionali di guarigione. Utilizzando un microscopio di vivere-imaging combinato con un incubatore a CO2 e controllo di temperatura adeguata, i ricercatori possono misurare le dimensioni di gap e il tasso di chiusura nel tempo mentre traccia il movimento di migrazione attivamente cellule situato alle punte della invasivo anteriore. Quindi, l'implementazione di imaging per monitorare la migrazione delle cellule cellule vive non solo fornirà la migliore visualizzazione della migrazione cellulare, ma permetterà anche la possibilità di distinguere tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule, fornendo così una più analisi affidabile della migrazione cellulare.

In questo studio, le cellule epiteliali del seno di MCF10A sono state utilizzate per dimostrare la combinazione del dosaggio di guarigione e di imaging per studiare il ruolo di TIP60 nella migrazione cellulare cellule vive. Lo svuotamento di TIP60 si traduce in capacità di aumento della migrazione in cellule di MCF10A.

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Protocollo

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1. preparazione

  1. Preparare il terreno di coltura di MCF10A: per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) / F12 (1:1) con 5% cavallo del siero, 20 ng/mL di fattore di crescita epiteliale, idrocortisone 0,5 mg/mL, tossina del colera 100 ng/mL e di 10 µ g/mL insulina.
  2. Preparare il medium senza siero: DMEM/F12 (1:1) con 20 ng/mL di fattore di crescita epiteliale, idrocortisone 0,5 mg/mL, la tossina del colera 100 ng/mL e di 10 µ g/mL insulina.
  3. Utilizzare la seguente sequenza di siRNA:
    siControl:
    Avanti: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
    Rovescio: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
    siTIP60:
    Avanti: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
    Rovescio: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
  4. Utilizzare piastre di coltura delle cellule di 10 cm e piastre da 24 pozzetti.

2. temporaneo esaurimento delle TIP60 utilizzando siRNA

  1. Il giorno 1, aliquota 15 µ l di reagente di transfezione (ad es., Lipofectamine RNAiMAX) e 2 mL di ridotto medio del siero (ad es., Opti-MEM) e mescolarle con 10 µ l di ogni siRNA (10 stock µM), rispettivamente.
  2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min.
  3. Semi di 1 x 106 MCF10A cellule insieme con 3 mL di terreno di coltura in un piatto di 10 cm. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
  4. Aggiungere la miscela di siRNA goccia a goccia per il piatto di 10 cm.
  5. Agitare il piatto per garantire che le cellule sono equamente distribuite prima di mettere in incubatore 37 ° C.
  6. Dopo 6 h di incubazione, è necessario sostituire il mezzo di siRNA-contenenti con 8 mL di terreno di coltura fresco.
  7. Il giorno 2, preparare un altro lotto di miscele di siRNA e li Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  8. Aspirare fuori 8 mL di terreno di coltura aggiunto il giorno 1 e sostituirlo con 3 mL di terreno di coltura fresco.
  9. Aggiungere il secondo lotto di siRNA miscela ai piatti goccia a goccia. Agitare i piatti per assicurarsi che i reagenti siano completamente mescolati prima di metterle in incubatrice.
  10. Dopo 6 h, sostituire il mezzo di siRNA-contenenti con 8 mL di terreno di coltura fresco.

3. le sementi celle per il dosaggio di guarigione

  1. Il giorno 3, eliminare il terreno e lavare le cellule una volta con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS) tampone. Gettare il tampone PBS.
  2. Tripsinizzano la siControl e le cellule trattate con siTIP60 aggiungendo 1 mL di tampone di tripsina EDTA 1x alla piastra. Rimetterlo in incubatrice per 20 min.
  3. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura completa per ogni piatto, risospendere le cellule pipettando e trasferirli in una provetta da 15 mL.
  4. Centrifugare a 200 g per 5 min e rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere le cellule con 5 mL di medium senza siero e contare le celle utilizzando un emocitometro.
  6. Preparare una sospensione di cellule di 6 x 105 cellule/mL per il siControl e il siTIP60; Assicurarsi che le celle siano ben miscelate. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per garantire confluency di 100%. 5 a 6 pozzetti ciascuna per siControl e siTIP60 del seme.
  7. Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e poi lato a lato per garantire la distribuzione uniforme. Evitare un movimento circolare. Lasciare la piastra nell'incubatore per 24 h.
  8. Raccogliere le cellule rimanenti per verificare l'efficienza atterramento di TIP60. A tale scopo, centrifugare la sospensione delle cellule rimanenti a 200 g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  9. Isolare il RNA usando un reagente commerciale, seguendo il protocollo del produttore e procedere alla PCR quantitativa in tempo reale per valutare l'efficienza di atterramento.

4. creare la ferita

  1. Controllare sotto un microscopio di contrasto di fase per garantire che le celle sono completamente collegate. Osservare le cellule sotto il microscopio (4x, 10x e 20 ingrandimenti) per garantire che le celle sono completamente collegate che ha formato un monostrato confluente di cellule.
    Nota: siControl cellule solitamente allegare meglio di cellule siTIP60. Questo è previsto perché lo svuotamento di TIP60 rende le cellule più mesenchymal-come20. Qui, viene utilizzato un microscopio di contrasto di fase luce bianca normale benchtop.
  2. Per generare la ferita, graffiare delicatamente una linea retta attraverso il centro del pozzo con una punta di pipetta 200 µ l; la lunghezza della ferita generata è lo stessa come il diametro del pozzo. Ripetere questo passaggio per tutti i restanti pozzetti. Usare un nuovo puntale per ciascun pozzetto.
  3. Lavare delicatamente ciascun pozzetto 5 volte utilizzando privo di siero medio per rimuovere le cellule indipendente.
  4. Aggiungere 1 mL di medium senza siero in ciascun pozzetto e procedere all'imaging di cellule vive.

5. installazione di Live cell Imaging

  1. Accendere il microscopio e la temperatura di controllo almeno 1 h prima dell'impostazione live cell imaging per assicurare che la temperatura nella camera di raggiunge i 37 ° C.
  2. Accendere l'alimentazione del gas di anidride carbonica (CO2) prima di iniziare l'imaging di cellule vive. Impostare la CO2 concentrazione al 5%.
  3. Posizionare la piastra a 24 pozzetti sul palco del microscopio e selezionare la lente dell'obiettivo con ingrandimento 10x per l'imaging. Dirigere la luce emessa per gli oculari invece la fotocamera e regolare la messa a fuoco per individuare la ferita e le cellule intorno ad esso.
    Nota: In questo caso, è stata utilizzata luce bianca con contrasto di fase.
  4. Utilizzare un sistema di cellule vive osservatore per segnare la posizione della ferita in ciascun pozzetto.
    Nota: La fase automatizzata del sistema di imaging cellule vive consente per l'acquisizione immagini a più posizioni. Immagini sono prese su ogni posizione segnata una volta ogni intervallo.
  5. Impostare la condizione di tempo: 1 h intervallo e la durata di 72 ore; secondo questa impostazione, il sistema avrà immagini ogni posizione contrassegnata ogni ora per 72 h. impostare qualsiasi intervallo di tempo desiderato e il periodo per il monitoraggio.
    Nota: Qui, una durata di 72 ore è migliore perché queste cellule cominciano a morire dopo 72 h in medium senza siero.

6. monitoraggio dei movimenti cella singola

  1. Esportare i dati dopo 72 h. esportare i dati come immagini in formato JPEG e come video in formato AVI.
    Nota: Questo è importante perché software ImageJ può riconoscere solo video in formato AVI. La velocità di migrazione differenti delle cellule fra le cellule di siTIP60 e siControl può essere osservato chiaramente nel video.
  2. Aprire il video AVI nel software ImageJ.
  3. Aprire il plugin MTrackJ (il plugin deve essere scaricato ed installato separatamente): Plugins > MtrackJ.
  4. Aggiungere una traccia per singole celle scelte dal video cliccando sulla scheda "Aggiungi" nella barra degli strumenti MtrackJ. Scegliere una cella all'estremità della parte anteriore dilagante e una cella che possa migrare in proprio (cella singola migrazione). Seguire il movimento delle cellule selezionate sul video e li traccia utilizzando MtrackJ.
  5. Misurare la distanza del movimento facendo clic sulla scheda "misura" della barra degli strumenti.
    Nota: Qui, quasi nessuna cellula nella siControl spostato come celluli, rendendo difficile misurare il movimento di singole cellule, considerando che molte delle cellule siTIP60 spostato come singole cellule. Tuttavia, il movimento delle cellule situate nella parte anteriore invasiva ancora possibile rintracciato e calcolato in cellule sia siControl e siTIP60.
  6. Salvare il video con le tracce in formato AVI.

7. quantificazione della capacità di migrazione delle cellule

  1. Per la quantificazione, selezionare immagini a 0 h e immagini a h "n", dove "n" si riferisce al timepoint cellule siTIP60 o siControl sono completamente chiuso la ferita.
    Nota: Qui, 48 h è stato scelto, come le ferite in siTIP60 cellule erano quasi completamente chiuso.
  2. Quantificare la percentuale migrazione usando ImageJ utilizzando la seguente formula: (area della ferita a 0 h - zona di ferita a "n" h) / area della ferita a 0 h x 100.

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Risultati

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Schema generale del saggio di migrazione di cellule vive basati su Imaging cellulare
Figura 1A è uno schema di questo protocollo. Cellule di MCF10A transfected con siControl ha mostrato la morfologia tipica epiteliale. Dopo l'esaurimento delle TIP60, cellule di MCF10A erano più mesenchymal rispetto alle cellule di controllo (Figura 1B).

Esame...

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Discussione

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È noto che nel processo di migrazione delle cellule, le cellule possono spostare sotto forma di fogli aderenti; cluster sciolti; o singole, isolate cellule. La modalità e la dinamica di invasione delle cellule può variare da uno stato a altro, e il fenotipo può cambiare nel giro di ore. Il tradizionale saggio di guarigione è basato su snapshot foto scattate da un microscopio con un intervallo di tempo, ad esempio 12 o 24 ore. Questo rende difficile catturare la dinamica della chiusura della ferita e il modello di movimen...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri del laboratorio GAI per loro utili discussioni e commenti. S.J. è stato sostenuto da sovvenzioni da il Singapore National Research Foundation e il Ministero dell'istruzione di Singapore sotto i suoi centri di ricerca dell'iniziativa di eccellenza per il cancro Science Institute di Singapore (R-713-006-014-271), la National Medical Consiglio di ricerca (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), il fondo di ricerca accademica del Ministero della pubblica istruzione (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 ott -04). Y.Z., G.S.C e C.Y.T. sono stati sostenuti da una borsa di studio post-laurea assegnato dal cancro Science Institute di Singapore, National University of Singapore.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellula MCF10AATCCCRL-10317TMcellule epiteliali mammarie
(1:1)Gibco11330-032MCF10A
Fattore di crescita epiteliale (EGF)PeprotechAF-100-15Integratori per terreni di coltura MCF10A
Tossina del coleraSigma-AldrichC-8052Integratori per terreni
di coltura MCF10AIdrocortisoneSigma-AldrichH-0888Integratori per terreni di coltura MCF10A
InsulinaSigma-AldrichI-1882Integratori per terreni di coltura MCF10A
Siero domesticoGibco16050-122Integratori per terreni di coltura MCF10A
TripsinaGibco25200-056Per MCF10A staccare da piastra
EmatocitometroFisher Scientific267110Per il conteggio delle cellule
Opti-MEM a siero ridottoGibco31985-070Per la miscela di siRNA
Lipofectamina RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Reagente per trasfetto
Reagente TrizolInvitrogen/Life Technologies15596-026Per l'estrazione di mRNA
Kit di sintesi iScript cDNABio-Rad170-8891Per cDNA generazione
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125Per il sistema di PCR veloce qPCR
7500 in tempo realeBiosystemsMechine qPCR in tempo reale Piatto
10 cmGreiner bio-one664160Per l'esperimento Knockdown
Piastra a 24 pozzettiCellstar662160Per il saggio di guarigione delle ferite
siControl siRNASelf progettatoAuto-progettatoCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNAAuto-progettatoAuto-progettatoUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Osservatore di cellule viveZeissZeiss Osservatore di cellule invertite per esperimenti su cellule vive
Terreno di coltura DMEM/F12 a Terreno di coltura da

Riferimenti

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