Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.
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Articolo metodologico
Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è il potenziale permanente della retina Teleostei per neurogenesi retinica e la rigenerazione dopo gravi danni. Studiando le vie di rigenerazione in zebrafish potrebbe portare a nuove comprensioni di sviluppare strategie innovative per il trattamento di malattie degenerative retiniche nei mammiferi. Qui, ci siamo concentrati sull'induzione di una lesione focale a retina esterna in zebrafish adulto per mezzo di un laser a diodo 532 nm. Una lesione localizzata permette di indagare i processi biologici che avvengono durante la degenerazione retinica e rigenerazione direttamente presso l'area di danno. Usando la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT), siamo stati in grado di definire la posizione della rigenerazione successiva area e monitor danneggiata in vivo. Infatti, la formazione immagine OCT produce immagini ad alta risoluzione, a sezione trasversale della retina zebrafish, fornendo informazioni che era precedentemente disponibile solo con le analisi istologiche. Al fine di confermare i dati da ott in tempo reale, sono state eseguite sezioni istologiche e risposta rigenerativa dopo l'induzione della lesione retinica è stata studiata da immunohistochemistry.
Introduzione
Visione è probabilmente il senso più essenziale dell'essere umano e la sua svalutazione ha un alto impatto socio-economico. Nei paesi industrializzati, le malattie degenerative retiniche rappresentano la maggior parte della perdita della vista e cecità fra la popolazione adulta1. Retinite pigmentosa (RP) è la causa ereditaria più comune di cecità nella gente fra le età di 20 e 60, che colpisce circa 1,5 milioni di persone in tutto il mondo2,3. È una famiglia eterogenea di malattie retiniche ereditarie caratterizzata da perdita progressiva dei fotorecettori (PRs) seguita da degenerazione....
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Protocollo
tutti gli esperimenti aderito all'istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e il rispetto dei relativi regolamenti delle autorità governative.
1. animali
- TgBAC mantenere (gfap:gfap-GFP) ceppo di zebrafish 167 (AB) di età compresa tra 6-9 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un ciclo luce/buio di 14/10 h 18.
- Seguire le istruzioni di cura degli animali delle istituzioni coinvolte per esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte delle autorità governative. <....
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Risultati
OCT in tempo reale: al fine di analizzare il ruolo di MCs in riparazione retinica, abbiamo usato un modello di lesione laser inducendo una zona ben delineata di danno nella retina zebrafish. Il sito del danno era imaged mediante OCT in vivo per la prima volta (giorno 0) entro 60 minuti dopo l'infortunio (Figura 3). Per compensare l'ottica del fish eye, una lente a contatto su misura è stato disposto sulla cornea. Immediatamente dopo .......
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Discussione
Rigenerazione/degenerazione retinica in zebrafish è stata studiata da diversi approcci quali citotossina-mediata delle cellule morte22, danno meccanico23e lesione termica24. Abbiamo impiegato un laser a diodo 532 nm per danneggiare la retina di zebrafish. In tal modo, il nostro modello offre diversi vantaggi. Per esempio, abbiamo creato rapidamente un'area ben definita di lesioni localizzate in retina esterna, in particolare nello strato PRs. Inoltre.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD per il suo contributo scientifico a stabilire il modello e Federica Bisignani per la sua eccellente assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di ematossilina acida | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 2852 | |
| Albumina | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | A07030 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI supporto di montaggio | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosina G soluzione acquosa 0,5% | Carl Roth, Arlesheim, Svizzera | X883.2 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 2860 | |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H& L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zugo, Svizzera | A11008 | |
| IgG H& L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Svizzera | A11020 | |
| Siero normale di capra | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Lenti a contatto in idrogel | Johnson & Johnson AG, Zug, Svizzera | n.a.1-Day | Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a.Methocel | 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonato | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germania | n.a.532 | nm laser |
| Mouse anticorpo monoclonale anti-GS | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania | n.a.Versione | 1.9.10.0 |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P5368 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P5368 | |
| Anticorpo policlonale anti-GFAP di coniglio | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Supporto per perno in silicone | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Tagliato a mano dal tappetino in silicone del vassoio di sterilizzazione di conseguenza. |
| Lampada a fessura BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a.Adattatore | |
| per lampada a fessura | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a.Vetrini | |
| Superfrost Plus Gehard | Menzel GmbH, Braunschweig, Germania | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germania | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Soluzione salina tamponata Tris (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | P1379 | |
| 78D lente per lampada a fessura senza contatto | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera | 534056 | |
| Lente laser per fondo oculare | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, Regno Unito | R2100-EU | Piroscafo |
Riferimenti
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
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Ristampe e permessi
