Viene presentato un protocollo per lo studio della desensibilizzazione e del recupero di sensibilità dei fotorecettori dei gamberi in funzione del tempo circadiano.
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Articolo metodologico
Desensibilizzazione e recupero dei fotorecettori dei gamberi al momento della consegna di uno stimolo leggero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Viene presentato un metodo per studiare la desensibilità e il recupero dei fotorecettori dei gamberi. Abbiamo eseguito registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in occhi con occhi isolati utilizzando la configurazione discontinua del morsetto a tensione a commutazione di elettrodi. In primo luogo, con una lama di rasoio abbiamo fatto un'apertura nella cornea dorsale per ottenere l'accesso alla retina. Successivamente, abbiamo inserito un elettrodo di vetro attraverso l'apertura e siamo penetrati in una cella come riportato dalla registrazione di un potenziale negativo. Il potenziale della membrana è stato bloccato al potenziale di riposo del fotorecettore ed è stato applicato un impulso luminoso per attivare le correnti. Infine, il protocollo light-flash è stato impiegato per misurare l'attuale desensibilizzazione e recupero. Il primo lampo di luce innesca, dopo un periodo di ritardo, la corrente ionica di trasduzione, che dopo aver raggiunto un picco di ampiezza decade verso uno stato desensibilizzato; il secondo flash, applicato a intervalli di tempo variabili, valuta lo stato della conduttanza attivata dalla luce. Per caratterizzare la corrente luminosa, sono stati misurati tre parametri: 1) latenza (il tempo trascorso tra la consegna del flash di luce e il momento in cui la corrente raggiunge il 10% del suo valore massimo); 2) corrente di picco; e 3) costante del tempo di desensibilità (costante temporale esponenziale della fase di decadimento corrente). Tutti i parametri sono influenzati dal primo impulso.
Per quantificare il recupero dalla desensibilizzazione, è stato impiegato il rapporto p2/p1 rispetto al tempo tra gli impulsi. p1 è la corrente di picco evocata dal primo impulso luminoso, e p2 è la corrente di picco evocata dal secondo impulso. Questi dati sono stati adattati a una somma di funzioni esponenziali. Infine, queste misurazioni sono state effettuate in funzione del tempo circadiano.
Introduzione
Per essere percepita come uno stimolo visivo, la luce che raggiunge gli occhi deve essere traspolata in un segnale elettrico. Quindi, in tutti gli organismi visivi, la luce innesca una corrente di ioni a trasduzione, che a sua volta produce un cambiamento nel potenziale della membrana delle cellule fotorecettrici, il cosiddetto potenziale recettore. A causa di questo, la sensibilità alla luce dell'occhio dipende principalmente dallo stato della luce attivata conduttanza, che può essere disponibile per essere attivato o desensibilizzato.
Nei fotorecettori dei gamberi, la luce innesca una corrente lenta, transitoria, ionica1. Al momento dell'illuminazione, la corrente di trasduzione si verifica dopo un ritardo o una latenza prima di raggiungere il suo massimo; successivamente decade, poiché i canali di trasduzione cadono in uno stato desensibilizzato in cui non rispondono a ulteriori stimoli luminosi2. Cioè, la luce, oltre ad attivare la corrente di trasduzione responsabile della visione, induce anche un decremento transitorio della sensibilità delle cellule fotorecettrici. La desensibilità può rappresentare un meccanismo protettivo generale contro la sovraesposizione a uno stimolo adeguato. La sensibilità dell'occhio alla luce viene recuperata man mano che la conduttanza della trasduzione si riprende dalla desensibilizzazione.
La registrazione intracellulare è una tecnica utile per misurare l'attività elettrica delle cellule eccitabili3,4,5,6,7,8. Anche se la registrazione intracellulare è diventata meno frequente con l'avvento della tecnica patch-clamp9, è ancora un approccio conveniente quando le celle sono difficili da isolare, o presentano una geometria che rende difficile la formazione delle guarnizioni giga-seal patch (cioè, sigilli o stretti contatti tra l'elettrodo patch e membrane con resistenza elettrica dell'ordine di 109ohms). Esempi di questi ultimi sono le cellule spermatozoi10 e le cellule fotorecettrici qui studiate. Nella nostra esperienza, i fotorecettori di Procambarus clarkii sono difficili da isolare e mantenere nella cultura primaria; inoltre, sono aste sottili che rendono difficile ottenere la formazione di giga-sigilli. Nelle registrazioni intracellulari, un elettrodo affilato viene avanzato in una cellula che viene mantenuta in posizione dal tessuto circostante. L'elettrodo viene tagliato dal circuito di commutazione ad alta velocità dell'amplificatore, quindi la corrente viene campionata tra gli impulsi di tensione. Questa modalità è nota come morsetto di tensione a singolo elettrodo discontinuo (modalità dSEVC)11. L'elevata resistenza (piccola apertura) dell'elettrodo ostacola lo scambio di diffusione tra la cellula e le soluzioni pipetta, producendo un disturbo minimo dell'ambiente intracellulare3. Un potenziale inconveniente di questa tecnica è che l'inserimento dell'elettrodo può produrre una corrente di perdita non selettiva; pertanto, è necessario prestare attenzione per evitare la registrazione da celle in cui le dimensioni della corrente di perdita possono interferire con le misure previste4,12.
Qui, usiamo occhi isolati di gamberi per valutare la desensibilità e il recupero della conduttanza iografica attivata dalla luce eseguendo registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in condizioni di morsetto di tensione.
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Protocollo
NOTA: Gli esperimenti rispettano le leggi sulla protezione degli animali del Messico.
1. Configurazione sperimentale
- Connessioni generali
- Collegare l'amplificatore a un computer adatto tramite un convertitore da analogico a digitale e utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'esperimento (Figura 1).
- Collegare il fotostimolatore all'A/D convertito.
- Camera di registrazione
- Posizionare la camera di registrazione su un tavolo anti-vibrazione e localizzarla all'interno di una gabbia di Faraday.
NOTA: Ciò impedisce la vibrazione meccanica e il rumore elettrico che possono influenzare la registrazione. La nostra gabbia di Faraday era fatta di rete metallica oscurata. Viene utilizzata una camera di registrazione acrilica fatta in casa (Figura 2). - Preparare la soluzione bagno per mantenere la preparazione in vita13: 205 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7.3.
NOTA: la soluzione non include il dextrose o qualsiasi bubbling del 95% O2, 5%co2 miscela perché la procedura sperimentale è abbastanza breve per rilevare i danni dalla registrazione elettrica (vedere passo 4.2.3 per completezza).
- Posizionare la camera di registrazione su un tavolo anti-vibrazione e localizzarla all'interno di una gabbia di Faraday.
- Elettrodi
- Utilizzare un elettrodo a filo d'argento rivestito in cloruro come elettrodo di riferimento
NOTA: il rivestimento in cloruro d'argento è necessario per consentire la reazionedell'elettrodo: AgCl(s) - e↔-ag(s)- . - Sand a silver wire (spessore : 1 mm, lunghezza , 10 cm) con una carta spalmata di qualità fine per pulirne la superficie.
- Sciacquare il filo d'argento con acqua distillata.
- Immergere il filo d'argento pulito in una soluzione di ipocloredi di sodio 4-6% (NaClO) fino a quando non appare scuro (circa 20 min).
- Utilizzare pipette di vetro sottili riempite con una soluzione elettrolitica (2,7 M KCl) come elettrodo intracellulare.
- Tirare un tubo capillare di vetro (diametro interno : 1 mm) con un tiratore a micropipetta per ottenere una punta sottile con una piccola apertura (0,01-0,1 m)14.
- Riempire il vetro capillare tirato con una soluzione KCl da 2,7 M. In primo luogo riempirlo per capillarità (immergere la punta della pipetta nella soluzione KCl da 2,7 m) e poi riempire la metà della pipetta con un ago a iniezione fine. Se necessario, toccare la pipetta elettrodo per eliminare le bolle d'aria.
- Collegare l'elettrodo al suo supporto. Collegare il supporto alla vela dell'amplificatore con l'amplificatore. Posizionare il porta-porta-testa dell'elettrodo con un micromanipolatore 3D stabile. Abbassare l'elettrodo fino a quando la soluzione del bagno copre la sua punta.
NOTA: l'elettrodo deve avere un orientamento verticale
- Utilizzare un elettrodo a filo d'argento rivestito in cloruro come elettrodo di riferimento
- Selezionare la modalità Bridge dell'amplificatore (nella sezione Modalità dell'amplificatore, premere il pulsante Bridge) e misurare la resistenza dell'elettrodo. Assicurarsi che la resistenza è di circa 50M. 11.
NOTA: Questa dimensione dell'elettrodo consente una registrazione elettrica di buona qualità con danni limitati alla cellula. - Annullare la corrente di offset e compensare i transitori capacitivi utilizzando il pulsante Posizione di tenuta nella sezione Morsetto di tensione dell'amplificatore e il pulsante Neutralizzazione di capacità nella sezione Microelectrode 1 dell'amplificatore.
- Sistema di superfusione
- Versare la soluzione di bagno (passaggio 1.2.2) in un recipiente adatto (una bottiglia di siero da 250 mL) e collegarla a un set di tubi di irrigazione (3,2 mm di diametro interno), collegando così la camera di registrazione. Utilizzare un sistema di superfusione a gravità. Regolare la portata a 0,5 mL/s.
- Collegare la camera ad un dispositivo di aspirazione. Regolare il sistema di aspirazione della soluzione in modo tale che il volume totale della camera di registrazione non vari. Utilizzare una pompa a vuoto per l'aspirazione.
NOTA: Un volume costante nella camera di registrazione è importante per mantenere costanti i capacità vaganti durante l'esperimento.
2. Materiale biologico
Nota: Utilizzare i gamberi adulti P. clarkii (7-10 cm di lunghezza) nella fase di intermolt del sesso indistinto.
- Tempo circadiano
- Un mese prima degli esperimenti, mantenere 100 gamberi sotto un ciclo scuro 12-h luce/12-h15 (luce bianca, 2,4 kW/m2).
NOTA: Un mese è il tempo sufficiente per sincronizzare la popolazione di gamberi. - Determinare il tempo circadiano della popolazione di gamberi valutando l'ampiezza degli elettroretinogrammi di cinque animali scelti casualmente15.
NOTA: 0 h tempo circadiano (CT 0) indica l'inizio di una giornata soggettiva, cioè,tempo durante il quale un organismo è normalmente attivo16,17,18,19( Figura3). Il gambero è un animale notturno, quindi sotto un ciclo scuro di 12-h di luce/12 h, è attivo durante la fase oscura.
- Un mese prima degli esperimenti, mantenere 100 gamberi sotto un ciclo scuro 12-h luce/12-h15 (luce bianca, 2,4 kW/m2).
- Procedura di isolamento di Eyestalk
- Nell'ora circadiana desiderata, anestesizzare un gambero selezionato per immersione in acqua di rubinetto a 0-4 gradi centigradi, per 15 min.
- Per mezzo di una forbice fine, staccare il gambo oleoso dalla base.
- Accedere alla retina utilizzando una lama di rasoio per fare un'apertura (1-mm2) nella cornea dorsale.
- Posizionare il gambo occhiali al centro della camera di registrazione (il foro coperto di silicone) con l'apertura di accesso alla retina sulla parte superiore della camera.
- Tieni il gambo occhi sotto l'oscurità costante per 20 min.
NOTA: 20 min è tempo sufficiente per la cellula fotorecettore per essere completamente scuro adattato.
3. Impalamento fotorecettore
- Mettere parallelamente il microelettrodo e l'asse longitudinale del gambo osta in modo tale che il microelettrodo sia centrato per l'accesso alla retina. Utilizzare un microscopio stereoscopico (10X) per posizionare i dispositivi nella configurazione corretta.
- Monitorare la differenza di tensione tra gli elettrodi di riferimento e di registrazione selezionando la modalità Bridge11 dell'amplificatore.
- Abbassare l'elettrodo nel bagno e successivamente posizionarlo proprio sopra la retina.
- Allontanare il microscopio e posizionare la lampada fotostimolatrice parallela all'asse longitudinale del gambo occhioso.
NOTA: La distanza tra la lampada e la camera di superfusione è di circa 15 cm. - Abbassare lentamente il microelettrodo fino a quando non viene rilevata una caduta improvvisa di tensione.
NOTA: Una caduta di tensione di circa 50 mV indica l'impalamento di una cellula fotocettore sana. - Fornire un lampo luminoso di prova (luce bianca, 7,2 kW/m2, 10 gradi di durata) per registrare il potenziale recettore del fotorecettore.
NOTA: Il potenziale recettore del fotorecettore è un potenziale depolarizzante di 10-15 mV di ampiezza e 300 ms di durata (Figura 4).
4. Registrazione elettrica
- Assicurarsi che le cellule fotorecettrici siano totalmente adattate alle condizioni scure (vedere il passaggio 2.3).
- Fornire un flash test-luce ogni 2 min. Automatizzare il tempo tra i flash scegliendo un valore adeguato (120 s) di "tempo tra gli episodi" nel software di acquisizione dati.
NOTA: 2 min è il tempo necessario per consentire il recupero totale delle correnti alla base della risposta elettrica del fotorecettore. - Monitorare il potenziale della membrana a riposo, così come l'ampiezza e la durata del potenziale recettore. Si supponga che il fotorecettore è completamente adattato una volta che il potenziale della membrana, ampiezza, e la durata del potenziale recettore rimangono invariati. I discorsi d'occhi precedentemente tenuti sotto l'oscurità costante per 20 min (fase 2.3) completano il loro adattamento in circa 5 min.
- Smettere di stimolare la cella 2 min prima di registrare la corrente illuminata.
- Fornire un flash test-luce ogni 2 min. Automatizzare il tempo tra i flash scegliendo un valore adeguato (120 s) di "tempo tra gli episodi" nel software di acquisizione dati.
- Registrazione corrente
- Bloccare la tensione al valore potenziale della membrana di riposo misurato della cella selezionando "Holding amplitude" nel software di acquisizione dati (in Waveform nella sezione Analog Output Channel).
- Selezionare la modalità dSEVC dell'amplificatore. Nella sezione Modalità dell'amplificatore, selezionare il pulsante SEVC e impostare la leva nella posizione Discont SEVC.
- Impostare la velocità di commutazione su 500-1.000 Hz (utilizzando il pulsante Regolazione della velocità dell'amplificatore), come determinato dalla velocità dell'elettrodo11.
- Consegnare un lampo di luce, e osservare l'afflusso di ioni evocati.
NOTA: Questa è la corrente di trasduzione o di luce(Figura 5). - Tornare alla modalità Bridge sull'amplificatore e registrare un potenziale recettore inviando un lampo luminoso (vedi sezione 3). Assicurarsi che la cellula fotorecettore sia totalmente adattata alle condizioni scure. Misurare le caratteristiche potenziali del recettore (ampiezza e durata) e confrontarle con le prime misurazioni. Si supponga che la cellula impalata del fotorecettore sia una cellula sana se ha le stesse caratteristiche.
NOTA: Dopo l'ablazione del gambo dell'occhio, la preparazione biologica è praticabile durante le seguenti 2 h.
- Protocollo a due impulsi: misurare il recupero dalla desensibilizzazione con un protocollo luce-flash a due.
NOTA: il protocollo light-flash è simile al protocollo standard di tensione a due impulsi utilizzato per misurare il recupero dall'inattivazione dei canali impolcati della tensione20. Il primo lampo luminoso provoca un cambiamento temporaneo nella sensibilità della cellula fotorecettore e il secondo flash valuta lo stato della conduttanza attivata dalla luce.- Fornire un paio di impulsi di luce. Applicare il secondo flash dopo un intervallo di tempo desiderato (da 300 ms a 2 min).
- Digitalizzale le correnti a un campionamento di 10 KHz con il software di acquisizione dati e salva i dati per l'analisi off-linea 11.
NOTA: Una tabella con i valori di configurazione del software è inclusa come materiale supplementare.
5. Analisi dei dati
- Cinetica della corrente illuminata dalla luce
- Misurare tre parametri di corrente: latenza di attivazione L, il tempo trascorso dalla consegna light-flash fino a quando la corrente raggiunge il 10% della sua ampiezza massima (Figura 5); ampiezza di corrente massima o massima Ip; e desensibilizzazione tempo costante T. Misurare la costante del tempo di desensibilizzazione (sezione) adattando la fase di decadimento corrente a:
dove, A - I (t) è una costante positiva (Figura 5).
- Misurare tre parametri di corrente: latenza di attivazione L, il tempo trascorso dalla consegna light-flash fino a quando la corrente raggiunge il 10% della sua ampiezza massima (Figura 5); ampiezza di corrente massima o massima Ip; e desensibilizzazione tempo costante T. Misurare la costante del tempo di desensibilizzazione (sezione) adattando la fase di decadimento corrente a:
- Desensibilizzazione e recupero
Nota: il recupero dalla desensibilità è stato valutato come il rapporto p2/p1, dove p1 è il parametro rilevante (L, Ipo T) della corrente di controllo e p2 è il parametro corrispondente della seconda test-corrente.- Grafico p2/p1 (L, Ipo T) in funzione del tempo tra gli impulsi.
- A seconda del parametro, adattare i punti di ogni stampa a:
o a:
- Utilizzare un test statistico appropriato per determinare il numero di termini esponenziali necessari per adattare i dati sperimentali.
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Risultati
In primo luogo, si ottiene un potenziale recettore rappresentativo delle cellule fotorecettrici dei gamberi (Figura 4). Successivamente, è stato applicato un test light-flash per attivare la corrente di trasduzione della luce (Figura 5). La corrente di trasduzione cationica1 si attiva dopo un ritardo, raggiungendo un massimo e successivamente scende lentamente in uno stato desensibilizzato assorbente da cu...
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Discussione
Il gambero ha dimostrato di essere un modello eccellente grazie alla sua capacità di sopravvivere in condizioni non naturali. C'è un facile accesso alle analisi elettrofisiologiche in vivo e in vitro. Inoltre, i crostacei sono un gruppo favorevole per la ricerca neurobiologica nel campo della cronobiologia comparativa21.
In questo articolo, lo studio della desensibilità e del recupero della corrente di trasduzione attivata dalla luce delle cellule foto...
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Dichiarazioni
Non abbiamo niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 sovvenzione. Gli autori vogliono ringraziare la signora Josefina Bolado, capo del dipartimento di traduzione scientifica della carta, da Divisiàn de Investigaciàn a Facultad de Medicina, UNAM, per aver modificato la versione in lingua inglese di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplificatore | |
| Digidata 1200 Interfaccia | Axon Instruments Inc | Digitalizzatore | |
| Oscilloscopio TDS430A | Oscilloscopio analogico | Tektronix | |
| Fotostimolatore PS33 Plus | Estrattore per lampada | per erba | |
| PC-100 | Estrattore per micropipette | Narishige | |
| P-97 | Sutter Instruments | Estrattore per micropipette | |
| Tubo capillare in vetro Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0,8, 1,10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Micromanipolatore Headstage | |
| MX-4 | Narishige | Micromanipolatore meccanico | |
| Microscopio stereoscopico Microscopio | Zeiss | ||
| pClamp | Axon Instruments Inc | Software di acquisizione dati per interfaccia digidata 1200 | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | Software di analisi collegato a pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Software di analisi dei dati e grafici | |
| Cloruro di sodio | Sigma | S7653 | >99,5% |
| Cloruro di potassio | Sigma | P-9333 | Minimo 99% |
| Solfato di magnesio | Sigma | M7506 | Minimo 99,5% |
| Cloruro di calcio | Sigma | C5080 | Minimo 99,0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99,5% |
| Idrossido di sodio | Sigma | S8045 | 98,00% |
| Soluzione di ipoclorito di sodio | Sigma | 425044 | Cloro disponibile, 10-15% |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
