Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

Sommario

Un protocollo di microiniezione semplice ed efficiente per l'editing di gene in embrioni di pesce gatto della manica usando il sistema CRISPR/Cas9 è presentato. In questo protocollo, guida RNA e proteina Cas9 erano microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Questo protocollo è stato convalidato battendo fuori due geni immuno-correlati di pesce gatto della manica.

Abstract

È stato sequenziato il genoma completo del channel catfish, Ictalurus punctatus, portando a maggiori opportunità per studiare la funzione del gene di pesce gatto della manica. Knockout del gene è stato utilizzato per studiare queste funzioni di gene in vivo. Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema è un potente strumento utilizzato per modificare le sequenze di DNA genomic per alterare la funzione del gene. Mentre l'approccio tradizionale è stato introdurre gli embrioni di singola cellula attraverso microiniezioni CRISPR/Cas9 mRNA, questo può essere un processo lento e inefficiente nel pesce gatto. Qui, un protocollo dettagliato per il microinjection di embrioni di pesce gatto della manica con CRISPR/Cas9 proteina è descritto. Brevemente, le uova e lo sperma sono stati raccolta e quindi artificiale fecondazione eseguita. Le uova fecondate sono state trasferite in una piastra Petri contenente soluzione di Holtfreter. Volume di iniezione è stato calibrato e poi guida RNAs/Cas9 targeting per il pedaggio/interleukin 1 recettore dominio contenenti adattatore molecola (TICAM 1) gene e ramnosio binding lectin (RBL) gene sono stati microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Il Ko del gene era successo come indels sono stati confermati dal sequenziamento del DNA. Le alterazioni della sequenza di proteina preveduta a causa di queste mutazioni incluso frameshift e troncato proteine a causa di codoni di stop prematuri.

Introduzione

Microiniezione è una comune tecnica di laboratorio utilizzata per distribuire una piccola quantità di una sostanza come DNA, RNA, proteine e altre macromolecole nelle cellule o embrioni attraverso un capillare di vetro¹. Microiniezione viene eseguita utilizzando l'installazione di attrezzature speciali tra cui un microinjector, micromanipolatore e un microscopio². La tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per modificare geneticamente molti organismi attraverso la generazione di transgenetica, TNA knockouts genica e la terapia genica, con l'obiettivo di comprendere le dinamiche di componenti intracellulari

Protocollo

Questo esperimento è stato condotto presso l'unità di ricerca genetica di pesce, E. W. Shell pesca Research Center, Auburn University, AL. Tutti i protocolli sperimentali utilizzati in questo esperimento sono stati approvati dal comitato di uso (AU-IACUC) e Auburn University istituzionale Animal Care prima che l'esperimento è stato avviato. Un elenco delle attrezzature e rifornimenti usati in questo esperimento può essere trovato nella tabella materiali. Di seguito sono i passaggi e le procedure di preparazione e microiniezione di embrioni di topo pesce gatto della manica come illustrato nella Figura 1.

1. selezi....

Risultati

Per dimostrare l'efficienza del protocollo microiniezione, gRNAs progettato per indirizzare il pesce gatto della manica pedaggio/interleukin 1 dominio contenenti adattatore molecola (TICAM1) del gene del recettore e ramnosio binding lectin (RBL) gene sono stati microiniettati.

TICAM 1
Sequenziamento del DNA di vettori da diverse colonie da pool, clonati prodotti di PCR ha rivelato le mutazioni indel indotte n.......

Discussione

È stato presentato un protocollo dettagliato per il microinjection di embrioni di pesce gatto della manica per raggiungere knockout del gene. Iniezione di proteine CRISPR/Cas9 nel tuorlo è molto più semplice, consente di risparmiare tempo e non richiede una formazione ampia rispetto ai microinjecting il blastodisc dell'embrione un cella, che è la tecnica più comune per la maggior parte di trasferimento genico e gene editing con pesce ^{30 , 42}. il protocollo attual.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reproboost impianto	Centro di Biotecnologia		Marina Ormone di rilascio luteinizzante analogo (LHRHa) per l'induzione dell'ovulazione nelle femmine di pesce gatto canale
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Per la sedazione dei pesci di riproduttore durante l'iniezione di ormoni e la rimozione delle uova.
Fenolo rosso	Sigma-Aldrich	P0290	0,5%, sterile filtrato
Stereomicroscopio	Olympus	213709	Per visualizzare le uova durante la microiniezione
Microiniettore	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modello MPPI-3	Per la consegna del materiale di iniezione negli embrioni
Micromanipolatore	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modello MM33	Per tenere e controllare il movimento dell'ago per iniezione.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	Per caricare la soluzione iniettabile in aghi per microiniezione.
Estrattore verticale dell'ago	David Kopf Instruments	Modello 720	Per l'estrazione di aghi per microiniezione
Cas9 proteina	PNA Bio Inc.	CP01	Proteina Cas9 ricombinante da Streptococcus pyrogenes.
Espandi il sistema PCR High FidelityPLUS	Roche Diagnostics, USA		Per la PCR e l'amplificazione di modelli di DNA da utilizzare nella preparazione del gRNA
Capillari in vetro borosilicato	Fisher Scientific		1 mm di diametro esterno (OD), per la realizzazione di aghi per microiniezione.
Piastra di Petri	VWR	25384-302	Per trattenere gli embrioni durante la microiniezione.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Grasso vegetale per rivestire pentole di deposizione delle uova e piastre di Petri.
soluzione di Holtfreter	Home Made		59 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,76 mM CaCl2, 1,67 mM MgSO4 per incubare gli embrioni microiniettati fino alla schiusa.
Doxiciclina iclilato USP (monoidrato)	Letco Medical	690904	antibiotico aggiunto alla soluzione di Holtfreter a 10 ppm per prevenire le infezioni batteriche.

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