Articolo metodologico

Costruzione e valutazione di un modello murino Osteolysis Calvarial tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo in allentamento asettico

DOI:

10.3791/56276

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17 febbraio 2018

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive un modello murino calvarial osteolisi da esposizione a particelle di CoCrMo, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule nella mobilizzazione asettica.

Abstract

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Osteolisi indotta da particelle di usura sono delle principali cause di allentamento asettico in un arthroplasty fallimento, ma il meccanismo di fondo rimane poco chiaro. A causa del lungo follow-up necessari al rilevamento ed avvenimento sporadico, è difficile per valutare l'osteolisi indotta da ofparticle patogenesi nei casi clinici. Quindi, modelli animali ottimale sono richiesti per ulteriori studi. Il modello murino di osteolysis calvarial stabilito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. Dopo due settimane, i topi sono stati sacrificati, e sono stati raccolti campioni di calvaria; valutazioni qualitative e quantitative sono state eseguite da ematossilina ed eosina e micro tomografia computata. I punti di forza di questo modello includono procedura semplicità, la valutazione quantitativa di perdita dell'osso, la rapidità di sviluppo di osteolisi, uso potenziale transgenico o Knock e un costo relativamente basso. Tuttavia, questo modello non può essere utilizzato per valutare la forza meccanica ed effetti cronici delle particelle in allentamento asettico. Modello murino osteolisi calvarial generato tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule, ad es., macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

Introduzione

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Mobilizzazione asettica è la causa più comune di arthroplasty totale dell'anca (THA) e guasto (TKA) arthroplasty totale del ginocchio, che richiede la chirurgia di revisione1. Tuttavia, il meccanismo di fondo rimane poco chiaro2. Un lungo follow-up è necessario per rilevare il osteolysis particella-indotto, cui il caso è raro; di conseguenza, è difficile per esplorare la relativa patogenesi nei casi clinici. Quindi, ulteriori studi concentrandosi sui complessi meccanismi cellulari e tessutali richiedono che entrambi gli esperimenti in vivo a indossano modelli osteolysis particella-indotto e saggi in vitro in cellule legate alle ossa omeostasi3. Un valido modello animale è importante nel rivelare gli effetti particelle di usura su perdita dell'osso, fornendo la prova per ulteriori test cellulari.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è un metodo efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, le particelle CoCrMo provocare osteolisi calvarial d'induzione di citochine infiammatorie in macrofagi, attivando gli osteoclasti, inibendo la proliferazione degli osteoblasti, e promuovendo l'apoptosi degli osteoblasti.

Ci vogliono solo due settimane per stabilire questo modello. Osteolisi possono essere visualizzato e quantificata con ematossilina ed eosina (H & E) e micro computato tomografia (micro-CT)2. Inoltre, questo modello ha un relativamente basso costo e transgenico e knockout mouse modelli possono essere utilizzati per lo screening di un gran numero di composti alle varie dosi3.

La procedura per stabilire e valutare questo modello è semplice. In primo luogo, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. I topi sono stati sacrificati dopo due settimane, e sono stati raccolti campioni di calvaria; analisi qualitative e quantitative sono state effettuate da H & E che macchia andmicro-CT.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra particelle CoCrMo e varie cellule, quali i macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Nanchino.

1. preparazione delle particelle CoCrMo

  1. Ottenere particelle CoCrMo utilizzando una corrente continua di fabbricato ad alto vuoto tre elettrodi4. Lega CoCrMo posto nello strumento sotto 10-3 Pa vuoto, 0,04 MPa argon e idrogeno 3:2 (v/v) e 650 A catodo attuale.
  2. Misurare i diametri delle particelle CoCrMo.
    1. Aggiungere 1 mg di CoCrMo particelle in 1,5 mL di etanolo anidro.
    2. Risospendere CoCrMo particelle in etanolo anidro agitando ad ultrasuoni a 28 kHz e 600 W per 5 min.
    3. Applicare una goccia (circa 20 µ l) della sospensione risultante sul tavolo oggettiva di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Serie di foto TEM a 200 kV tensione di accelerazione e 0,24 nm risoluzione di cattura.
    4. Utilizzare il software fornito per calcolare la distribuzione delle dimensioni della particella e di diametro media in micrografie TEM.
  3. Decontaminare le endotossine
    1. Autoclave 50g di particelle per 15 min a 121 ° C e 15 psi.
    2. Rilevare le endotossine da un'analisi quantitativa di Limulus metodo Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL è stato considerato per indicare assenza di endotossina)5.
  4. Risospendere le particelle in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL come soluzione di riserva6.

2. costruzione del modello Calvarial osteolisi

  1. Anestetizzare 6 settimane di età C57BL/J6 topi (sei topi per gruppo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilizzare il pinch test per valutare il livello di anestesia. Prevenire la secchezza degli occhi con normale soluzione salina.
  2. Posto topi in posizione prona. Rimuovere la pelliccia sul cranio con un rasoio e disinfetti la pelle usando batuffoli di cotone medico contenente etanolo di 75%.
  3. Per la localizzazione del punto, identificare due punti, inclusi i punti medi tra i due occhi e orecchie, rispettivamente. Quindi, determinare la linea tra i due punti e incise la pelle lungo la linea di cui sopra con le forbici (Figura 1A).
  4. Rimuovere il periostio cranico dalla calvaria con un bisturi (Figura 1B)6.
  5. Pelle di sutura a entrambe le estremità con semplice sutura interrotto.
  6. Fare una linea di sutura nel mezzo dell'incisione senza annodatura. Tenere le due estremità della linea di sutura.
  7. Incorporare 50 µ l di sospensione di particelle di CoCrMo (50 mg/mL, in PBS) nel mezzo del calvarias (Figura 1)2.
  8. Annodare l'ultimo punto all'interno di semplice sutura interrotto (Figura 1).
  9. Mantenere topi per altre 2 settimane.

3. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial scansionando Micro-CT

  1. Sacrificare i topi con anidride carbonica. Decapitare i topi nel piano orizzontale. Rimuovere il tessuto cerebrale all'interno e la pelle e pelliccia all'esterno. Raccogliere il calvarias per ulteriori esperimenti.
  2. Tutti i tessuti molli il calvaria delicatamente chiaro con le pinzette. Difficoltà il calvarias liquidati in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. Immergere il calvarias in PBS 24 h prima di micro-TAC.
  3. Analizzare il calvarias di topi di micro-CT ad alta definizione a una risoluzione isometrica di 18 µm e le impostazioni di energia dei raggi x di 45 kV e 550 mA.
  4. Condurre la ricostruzione tridimensionale di dati micro-CT con il software.
  5. Analisi quantitativa e qualitativa.
    1. In primo luogo, selezionare l'area quadrata intorno la sutura mediana come la regione di interesse.
    2. In secondo luogo, misurare la densità minerale ossea (BMD), osso volume/totale volume (BV/TV), trabecular numero (Tb.N), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) e percentuale di porosità totale con il software fornito per micro-CT.
    3. In terzo luogo, confrontare i tre gruppi per varie misure di One-way ANOVA. Per post-hoc analisi della varianza, applicare il metodo di Bonferroni2.

4. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial macchiando di H & E

  1. Decalcificare campioni di calvaria in 15% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiare la soluzione di decalcificazione ogni giorno per 3 settimane.
  2. Incorporare i campioni decalcificati in paraffina per 2 cm x 1 cm x 1 cubo di cm e tagliateli a fettine in 2 sezioni di µm nella zona di deposizione delle particelle.
  3. Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina come precedentemente descritto7.
  4. Catturare micrografie della pathomorphism complessiva da microscopia chiara.

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Risultati

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Le particelle di CoCrMo in-house prodotta su scala nanometrica erano circa 50 nm (errore standard di 3,56) di diametro, come quantificato dal TEM (Figura 2). Dopo l'esposizione del mouse calvarias a particelle di CoCrMo, gli animali (n = 6 per ogni gruppo) sono stati mantenuti per un altro due settimane. Entro le due settimane, l'incisione calvarial era completamente guarito e la sutura può cadere. Qualsiasi infezione locale o non sindacale può influire sulla...

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Discussione

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Ci sono due metodi principali per usura osteolysis particella-indotto in topi: il modello aria-sacchetto e il modello di calvarial osteolisi. Nel modello aria-sacchetto, un sacchetto di aria generato per via sottocutanea è stabilito in primo luogo, seguito da introduzione delle particelle di usura e l'impianto nel tessuto osseo8. Il muro di sacchetto imita il periostio in allentamento asettico. Tuttavia, l'impianto osseo è non vascolare con nessuna attività biologica, che lo rende difficile valuta...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da National Natural Science Foundation of China (81572111), la scienza clinica e tecnologia progetto Fondazione della provincia di Jiangsu (BL2012002), il progetto di ricerca scientifica di Nanchino (201402007), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20161385) e la fondazione speciale dell'associazione cinese medico (2015COS0810).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lega CoCrMo da protesiWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIMateria prima per ottenere nanoparticelle di CoCrMo
Fabbricato ad alto vuoto a corrente continua a tre elettrodiCollege of Materials Science & Ingegneria, Nanjing University of TechnologyMacchina auto-progettata Maschio
C57BL / 6J topimodello di 6 settimane Centro di ricerca animale dell'Università di NanchinoN000013
100% etanoloNanjing ReagenteC0691514023Solvente di nanoparticelle CoCrMo per la scansione al microscopio elettronico a trasmissione
1,5 ml Provette per microcentrifugaTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDBilancia microanalitica W603
Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTDEX125DZH
Agitatore ad ultrasuoniShanghai Yuhao strumento scientifico co., LTDYH-200DHPer sospendere le nanoparticelle di CoCrMo
Trasmissione Microscopio elettronicoFEITecnai G20
SimplePCI softwareCompix Inc.Versione 6.6Per calcolare il diametro medio e la distribuzione granulometrica.
Vasca di sterilizzazione ad alta portataQIULONGYIQIKYQL-100DSPer decontaminare l'endotossina
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) SaggioCharles RiverR13025Per rilevare l'endotossina 
Provette per microcentrifuga da 15 mlTaizhou Suyi MedicalB122
Soluzione salina tamponata con fosfatoBoster Tecnologia biologicaAR0030Solvente di nanoparticelle CoCrMo soluzione stock
Pentobarbital SodicoSigmaP3761Per anestetizzare i topi
Soluzione salina normaleSACKLERSR8572EP-15Per prevenire la secchezza degli occhi dei topi
75% EtanoloNanjing ReagenteC0691560275Disinfezione
Batuffolo di cotone medicoShuitao1278298933Rasoio per disinfezione
KemeiKM-3018Per radere la pelliccia
ForbiceRWD LIFE SCIENCES12005-10Per incidere la pelle
SuturaRWD LIFE SCIENCEF34001-01Per suturare la pelle
Porta agoRWD LIFE SCIENCEF33001-01Per suturare la pelle
AgoRWD LIFE SCIENCER14003-12Per suturare la pelle
Pinze per vasiRWD LIFE SCIENCEF22003-09Per suturare la pelle
BisturiRWD LIFE SCIENCES31010-01Per raccogliere pinzette calvaria
RWD LIFE SCIENCEF12006-10Per raccogliere calvaria
100 µ L pipetteEppendorf3120000240Per incorporare particelle in sospensione nel calvatias
100 µ L puntali per pipetteAXYGENT-200-YPer incorporare la sospensione di particelle nelle calvatias
5 ml MicroprovetteTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldeideServicebioG1101Fissazione
Micro Tomografia computerizzata SkyScanSkyScan1176
Acido etilendiammina tetraaceticoServicebioG1105Decalcificazione
ParaffinaServicebio#0001
Affettatrice per paraffinaLeicaRM2125RTS
VetrinoServicebioG6004
Vetro di coperturaServicebio200
Kit di colorazione HEServicebio#1-5Microscopio
otticoNikonE200
di colorazione HE

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
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