Questo manoscritto descrive un modello murino calvarial osteolisi da esposizione a particelle di CoCrMo, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule nella mobilizzazione asettica.
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Articolo metodologico
Costruzione e valutazione di un modello murino Osteolysis Calvarial tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo in allentamento asettico
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Osteolisi indotta da particelle di usura sono delle principali cause di allentamento asettico in un arthroplasty fallimento, ma il meccanismo di fondo rimane poco chiaro. A causa del lungo follow-up necessari al rilevamento ed avvenimento sporadico, è difficile per valutare l'osteolisi indotta da ofparticle patogenesi nei casi clinici. Quindi, modelli animali ottimale sono richiesti per ulteriori studi. Il modello murino di osteolysis calvarial stabilito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. Dopo due settimane, i topi sono stati sacrificati, e sono stati raccolti campioni di calvaria; valutazioni qualitative e quantitative sono state eseguite da ematossilina ed eosina e micro tomografia computata. I punti di forza di questo modello includono procedura semplicità, la valutazione quantitativa di perdita dell'osso, la rapidità di sviluppo di osteolisi, uso potenziale transgenico o Knock e un costo relativamente basso. Tuttavia, questo modello non può essere utilizzato per valutare la forza meccanica ed effetti cronici delle particelle in allentamento asettico. Modello murino osteolisi calvarial generato tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule, ad es., macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.
Introduzione
Mobilizzazione asettica è la causa più comune di arthroplasty totale dell'anca (THA) e guasto (TKA) arthroplasty totale del ginocchio, che richiede la chirurgia di revisione1. Tuttavia, il meccanismo di fondo rimane poco chiaro2. Un lungo follow-up è necessario per rilevare il osteolysis particella-indotto, cui il caso è raro; di conseguenza, è difficile per esplorare la relativa patogenesi nei casi clinici. Quindi, ulteriori studi concentrandosi sui complessi meccanismi cellulari e tessutali richiedono che entrambi gli esperimenti in vivo a indossano modelli osteolysis particella-indotto e saggi in vitro in cellule legate alle ossa omeostasi3. Un valido modello animale è importante nel rivelare gli effetti particelle di usura su perdita dell'osso, fornendo la prova per ulteriori test cellulari.
Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è un metodo efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, le particelle CoCrMo provocare osteolisi calvarial d'induzione di citochine infiammatorie in macrofagi, attivando gli osteoclasti, inibendo la proliferazione degli osteoblasti, e promuovendo l'apoptosi degli osteoblasti.
Ci vogliono solo due settimane per stabilire questo modello. Osteolisi possono essere visualizzato e quantificata con ematossilina ed eosina (H & E) e micro computato tomografia (micro-CT)2. Inoltre, questo modello ha un relativamente basso costo e transgenico e knockout mouse modelli possono essere utilizzati per lo screening di un gran numero di composti alle varie dosi3.
La procedura per stabilire e valutare questo modello è semplice. In primo luogo, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. I topi sono stati sacrificati dopo due settimane, e sono stati raccolti campioni di calvaria; analisi qualitative e quantitative sono state effettuate da H & E che macchia andmicro-CT.
Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra particelle CoCrMo e varie cellule, quali i macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Nanchino.
1. preparazione delle particelle CoCrMo
- Ottenere particelle CoCrMo utilizzando una corrente continua di fabbricato ad alto vuoto tre elettrodi4. Lega CoCrMo posto nello strumento sotto 10-3 Pa vuoto, 0,04 MPa argon e idrogeno 3:2 (v/v) e 650 A catodo attuale.
- Misurare i diametri delle particelle CoCrMo.
- Aggiungere 1 mg di CoCrMo particelle in 1,5 mL di etanolo anidro.
- Risospendere CoCrMo particelle in etanolo anidro agitando ad ultrasuoni a 28 kHz e 600 W per 5 min.
- Applicare una goccia (circa 20 µ l) della sospensione risultante sul tavolo oggettiva di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Serie di foto TEM a 200 kV tensione di accelerazione e 0,24 nm risoluzione di cattura.
- Utilizzare il software fornito per calcolare la distribuzione delle dimensioni della particella e di diametro media in micrografie TEM.
- Decontaminare le endotossine
- Autoclave 50g di particelle per 15 min a 121 ° C e 15 psi.
- Rilevare le endotossine da un'analisi quantitativa di Limulus metodo Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL è stato considerato per indicare assenza di endotossina)5.
- Risospendere le particelle in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL come soluzione di riserva6.
2. costruzione del modello Calvarial osteolisi
- Anestetizzare 6 settimane di età C57BL/J6 topi (sei topi per gruppo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilizzare il pinch test per valutare il livello di anestesia. Prevenire la secchezza degli occhi con normale soluzione salina.
- Posto topi in posizione prona. Rimuovere la pelliccia sul cranio con un rasoio e disinfetti la pelle usando batuffoli di cotone medico contenente etanolo di 75%.
- Per la localizzazione del punto, identificare due punti, inclusi i punti medi tra i due occhi e orecchie, rispettivamente. Quindi, determinare la linea tra i due punti e incise la pelle lungo la linea di cui sopra con le forbici (Figura 1A).
- Rimuovere il periostio cranico dalla calvaria con un bisturi (Figura 1B)6.
- Pelle di sutura a entrambe le estremità con semplice sutura interrotto.
- Fare una linea di sutura nel mezzo dell'incisione senza annodatura. Tenere le due estremità della linea di sutura.
- Incorporare 50 µ l di sospensione di particelle di CoCrMo (50 mg/mL, in PBS) nel mezzo del calvarias (Figura 1)2.
- Annodare l'ultimo punto all'interno di semplice sutura interrotto (Figura 1).
- Mantenere topi per altre 2 settimane.
3. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial scansionando Micro-CT
- Sacrificare i topi con anidride carbonica. Decapitare i topi nel piano orizzontale. Rimuovere il tessuto cerebrale all'interno e la pelle e pelliccia all'esterno. Raccogliere il calvarias per ulteriori esperimenti.
- Tutti i tessuti molli il calvaria delicatamente chiaro con le pinzette. Difficoltà il calvarias liquidati in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. Immergere il calvarias in PBS 24 h prima di micro-TAC.
- Analizzare il calvarias di topi di micro-CT ad alta definizione a una risoluzione isometrica di 18 µm e le impostazioni di energia dei raggi x di 45 kV e 550 mA.
- Condurre la ricostruzione tridimensionale di dati micro-CT con il software.
- Analisi quantitativa e qualitativa.
- In primo luogo, selezionare l'area quadrata intorno la sutura mediana come la regione di interesse.
- In secondo luogo, misurare la densità minerale ossea (BMD), osso volume/totale volume (BV/TV), trabecular numero (Tb.N), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) e percentuale di porosità totale con il software fornito per micro-CT.
- In terzo luogo, confrontare i tre gruppi per varie misure di One-way ANOVA. Per post-hoc analisi della varianza, applicare il metodo di Bonferroni2.
4. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial macchiando di H & E
- Decalcificare campioni di calvaria in 15% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiare la soluzione di decalcificazione ogni giorno per 3 settimane.
- Incorporare i campioni decalcificati in paraffina per 2 cm x 1 cm x 1 cubo di cm e tagliateli a fettine in 2 sezioni di µm nella zona di deposizione delle particelle.
- Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina come precedentemente descritto7.
- Catturare micrografie della pathomorphism complessiva da microscopia chiara.
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Risultati
Le particelle di CoCrMo in-house prodotta su scala nanometrica erano circa 50 nm (errore standard di 3,56) di diametro, come quantificato dal TEM (Figura 2). Dopo l'esposizione del mouse calvarias a particelle di CoCrMo, gli animali (n = 6 per ogni gruppo) sono stati mantenuti per un altro due settimane. Entro le due settimane, l'incisione calvarial era completamente guarito e la sutura può cadere. Qualsiasi infezione locale o non sindacale può influire sulla...
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Discussione
Ci sono due metodi principali per usura osteolysis particella-indotto in topi: il modello aria-sacchetto e il modello di calvarial osteolisi. Nel modello aria-sacchetto, un sacchetto di aria generato per via sottocutanea è stabilito in primo luogo, seguito da introduzione delle particelle di usura e l'impianto nel tessuto osseo8. Il muro di sacchetto imita il periostio in allentamento asettico. Tuttavia, l'impianto osseo è non vascolare con nessuna attività biologica, che lo rende difficile valuta...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da National Natural Science Foundation of China (81572111), la scienza clinica e tecnologia progetto Fondazione della provincia di Jiangsu (BL2012002), il progetto di ricerca scientifica di Nanchino (201402007), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20161385) e la fondazione speciale dell'associazione cinese medico (2015COS0810).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lega CoCrMo da protesi | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Materia prima per ottenere nanoparticelle di CoCrMo |
| Fabbricato ad alto vuoto a corrente continua a tre elettrodi | College of Materials Science & Ingegneria, Nanjing University of Technology | Macchina auto-progettata Maschio | |
| C57BL / 6J topi | modello di 6 settimane Centro di ricerca animale dell'Università di Nanchino | N000013 | |
| 100% etanolo | Nanjing Reagente | C0691514023 | Solvente di nanoparticelle CoCrMo per la scansione al microscopio elettronico a trasmissione |
| 1,5 ml Provette per microcentrifuga | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | Bilancia microanalitica W603 | |
| Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | ||
| Agitatore ad ultrasuoni | Shanghai Yuhao strumento scientifico co., LTD | YH-200DH | Per sospendere le nanoparticelle di CoCrMo |
| Trasmissione Microscopio elettronico | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | Versione 6.6 | Per calcolare il diametro medio e la distribuzione granulometrica. |
| Vasca di sterilizzazione ad alta portata | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | Per decontaminare l'endotossina |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Saggio | Charles River | R13025 | Per rilevare l'endotossina |
| Provette per microcentrifuga da 15 ml | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Boster Tecnologia biologica | AR0030 | Solvente di nanoparticelle CoCrMo soluzione stock |
| Pentobarbital Sodico | Sigma | P3761 | Per anestetizzare i topi |
| Soluzione salina normale | SACKLER | SR8572EP-15 | Per prevenire la secchezza degli occhi dei topi |
| 75% Etanolo | Nanjing Reagente | C0691560275 | Disinfezione |
| Batuffolo di cotone medico | Shuitao | 1278298933 | Rasoio per disinfezione |
| Kemei | KM-3018 | Per radere la pelliccia | |
| Forbice | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | Per incidere la pelle |
| Sutura | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | Per suturare la pelle |
| Porta ago | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | Per suturare la pelle |
| Ago | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | Per suturare la pelle |
| Pinze per vasi | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | Per suturare la pelle |
| Bisturi | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | Per raccogliere pinzette calvaria |
| RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | Per raccogliere calvaria | |
| 100 µ L pipette | Eppendorf | 3120000240 | Per incorporare particelle in sospensione nel calvatias |
| 100 µ L puntali per pipette | AXYGEN | T-200-Y | Per incorporare la sospensione di particelle nelle calvatias |
| 5 ml Microprovette | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldeide | Servicebio | G1101 | Fissazione |
| Micro Tomografia computerizzata | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Acido etilendiammina tetraacetico | Servicebio | G1105 | Decalcificazione |
| Paraffina | Servicebio | #0001 | |
| Affettatrice per paraffina | Leica | RM2125RTS | |
| Vetrino | Servicebio | G6004 | |
| Vetro di copertura | Servicebio | 200 | |
| Kit di colorazione HE | Servicebio | #1-5 | Microscopio |
| ottico | Nikon | E200 |
Riferimenti
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
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