I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.
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Articolo metodologico
Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo terapeutico per la malattia arteriosa periferica e malattia cardiaca ischemica è quello di aumentare il flusso di sangue al aree ischemiche causata da stenosi emodinamica. Chirurgia vascolare è un'opzione praticabile in casi selezionati, ma per i pazienti senza indicazioni per la chirurgia come progressione di lavorare o riposare dolore, ischemia critica degli arti o gravi perturbazioni alla vita, ci sono poche possibilità per mitigare la loro malattia. Terapia cellulare tramite aspersione del monocito-aumentato attraverso la stimolazione della formazione collaterale è una delle poche opzioni non invasive.
Il nostro gruppo esamina arteriogenesi dopo trapianto del monocito in topi utilizzando il modello di ischemia del hindlimb. Precedentemente, abbiamo dimostrato miglioramento nell'arto posteriore aspersione mediante trapianto di tetano-stimolata syngeneic del monocito. Oltre agli effetti sulla formazione collaterale, la crescita del tumore potrebbe risentire anche questa terapia. Per studiare questi effetti, utilizziamo un modello di topo scantinato membrana-come matrice iniettando la matrice extracellulare del sarcoma Engelbreth-Holm-sciame nel fianco del mouse, dopo l'occlusione dell'arteria femorale.
Dopo gli studi di tumore artificiale, utilizziamo la microscopia intravital per studiare in vivo angiogenesi del tumore e del monocito homing all'interno delle arterie collaterali. Precedenti studi hanno descritto l'esame istologico dei modelli animali, che presuppone l'analisi successiva agli artefatti post mortem . Il nostro approccio Visualizza homing monocito al aree di collateralization in sequenze di tempo reale, è facile da eseguire e indaga il processo di angiogenesi del tumore e arteriogenesi in vivo.
Introduzione
Malattie cardiovascolari, tra cui malattia coronarica o malattia arteriosa periferica, sono le più comuni cause di morte a livello globale1. La terapia cellulare è un promettente approccio per curare le malattie cardiovascolari, in particolare per le persone che non sono in grado di sottoporsi a interventi chirurgici. Ci sono diversi approcci per utilizzare cellule o loro sostanze secrete come strumento terapeutico2,3, con l'obiettivo generale di migliorare la perfusione e mantenere la funzione del tessuto ischemico e underperfused. Un tentativo di raggiungere questo obiettivo è migliorare arteriogenesi, che favorisce lo sviluppo delle arterie collaterali. I monociti sono un tipo di cellula importante connesso con collateralization. Il nostro gruppo si è concentrata sulla ricerca degli effetti dei monociti nelle aree di infiammazione4,5, in particolare utilizzando il modello di ischemia del hindlimb per indurre ischemia e conseguente infiammazione6. Monociti sede di aree di infiammazione e provocare risposte sistemiche complesse che portano allo sviluppo di collateralization7.
Con l'uso di microscopia intravital, possiamo studiare il comportamento di queste cellule in vivo e osservare l'homing dei monociti iniettati ad aree di infiammazione. Maggior parte degli studi ex descrivono solo post-mortem analisi, che tengono gli svantaggi tra cui l'introduzione di artefatti istologici e gran numero di animali necessari per le preparazioni. Con il nostro approccio, possiamo analizzare processi immunologici e formazione collaterale via live imaging più intervalli di tempo.
Oltre allo sviluppo delle arterie collaterali in aree ischemiche, monociti anche influenzano la crescita del tumore. Per studiare questi processi, abbiamo iniettare una matrice del tipo di membrana dello scantinato estratta dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm, un tumore ricco di matrice extracellulare proteine8e analizzare utilizzando la microscopia intravital. Questa matrice è utilizzata per molecole di screen test per formazione di rete delle cellule endoteliali o terapie anti-cancro attraverso inibizione angiogenica; in questo caso, si valuterà il potenziale di angiogenesi del tumore dei monociti per cella terapia9,10,11.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare un modo facile ed efficiente per lo studio dei processi immunologici causati da ischemia in un modello in vivo . Possiamo generare un ambiente di test più realistico rispetto ad un workup istologico post-mortem del tessuto del muscolo.
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Protocollo
il nostro studio è stato svolto con il permesso dello stato della Sassonia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, ai sensi dell'articolo 8 della legge tedesca per la protezione degli animali. (§ 8, comma 1 della legge tedesca per la protezione degli animali da 18.05.2016 - BGBl. I s. 1206, 1313, TierSchVersV § 31 da 13.08.2013).
Nota: per gli esperimenti qui, sono stati usati 8 a 12 topi BALB/c maschili a settimana vecchio e monociti umani da donatori di sangue sono stati utilizzati per la visualizzazione dei monociti tramite microscopia intravital.
1. preparazione delle cellule
Nota: per l'isolamento dei monociti, nostro precedente pubblicato un video su Giove per istruzioni, vedere: " isolamento e iniezione endovenosa di murino del midollo osseo derivato Monociti " di Wagner et al. 4
Nota: quando lavorano con le cellule di tutti i passaggi devono essere sterile per evitare la contaminazione.
- Macchiatura delle cellule con 3,3 '-perclorato di Dioctadecyloxacarbocyanine
- risospendere le cellule in terreno di coltura libera del siero con una densità di 1 x 10 6 cellule/mL.
Nota: Solo mezzo libero del siero permette una colorazione efficiente, poiché il colorante lipofilico altrimenti sarebbe già essere catturato dai componenti lipofilici del siero. - Aggiungere 5 µ l di 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato in dimetilformammide a 1 mL di sospensione cellulare e Risospendere accuratamente.
- Incubare la soluzione di cella a 37 ° C per 20 min.
- Centrifugare le cellule a 37 ° C e 500 x g per 5 min.
- Sloggiare il supernatante e risospendere le cellule con il mezzo di 37 ° C caldo fetale di vitello siero completato.
- Ripetere due volte i passaggi 1.1.4 e 1.1.5.
- Contare le celle con la formula:
- risospendere le cellule con soluzione sterile 0,9% NaCl 150 µ l.
- Iniettare le cellule nella vena caudale.
- risospendere le cellule in terreno di coltura libera del siero con una densità di 1 x 10 6 cellule/mL.
2. Anestesia
- Anestesia inalazione
- vaporizzare isoflurane con l'aiuto di un vaporizzatore usando una concentrazione del 5% in un contenitore chiuso sotto una cappa di sicurezza chimica.
- Gestire il mouse con attenzione e metterlo nel Cestino.
- Gestire l'animale dalla pelle del collo posteriore, dopo che ha smesso di muoversi.
- Intraperitoneale anestesia
Nota: anestesia di uso isoflurano, descritto al punto 2.1, per eseguire un'iniezione intraperitoneale. Con il recupero veloce e breve durata d'azione effetto narcotico dell'anestesia isoflurano, è più facile gestire il mouse e iniettare anestesia intraperitoneale.- Utilizzare una soluzione di 2,4 mL ketamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL di NaCl (0,9%) per l'iniezione intraperitoneale.
- Pesare l'animale prima di applicare anestetico.
Nota: La formula per l'anestetico è:
- utilizzare una siringa da insulina 1 mL con ago 30g per iniettare la soluzione nel ventre sinistro.
- Posizionare il mouse nella sua gabbia e attendere per effetto narcotico.
Nota: L'effetto narcotico appare normalmente entro 5 min se l'iniezione è stata completata. La corretta profondità dell'anestesia può essere determinata da assenza di riflesso coperchio o reazione al pizzico di punta, così come un tasso normale, controllato di respirazione.
3. L'impianto della membrana dello scantinato-come matrice
Nota: questo metodo è utilizzato dal nostro gruppo per studiare l'angiogenesi del tumore dopo l'iniezione del monocito. A seconda degli esperimenti, fattori di crescita possono essere aggiunti alla matrice della membrana dello scantinato-come. Abbiamo effettuato la legatura dell'arteria femorale prima di iniettare il tumore nel fianco del mouse. La matrice deve avere una temperatura di 4 ° C per l'iniezione. A questa temperatura, la matrice è fluido; il gel si indurisce in un solido a temperatura corporea (37 ° C). Per una migliore visibilità della matrice sottocutanea spina, radere la pelle del mouse al sito di iniezione.
Nota: opzionale: 26 U.I. eparina in condizioni sterili alla matrice della membrana dello scantinato-come fattore di crescita del fibroblasto base di aggiungere 100 ng e 300 fattore di crescita endoteliale vascolare ng.
- Caricare 1 mL di matrice in una siringa da insulina 30G e conservare il ghiaccio fino all'uso.
- Gettare l'animale sul tavolo e tenere la pelle del mouse accanto al sito di iniezione sul fianco.
- Iniettare per via sottocutanea 500 µ l della matrice della membrana dello scantinato-come.
Nota: Per motivi pratici, è necessario immettere la matrice del tipo di membrana dello scantinato in modo compatto in un'unica sede per evitare la dispersione sottocutaneo. Sarà più facile rimuovere il tumore dal tessuto artificiale dopo sacrificare il mouse alla fine dell'esperimento.
4. Iniezione della vena della coda
Nota: praticare l'iniezione della vena della coda con soluzione di NaCl su animali da esperimento prima sperimentazione. Se i monociti non possono essere adeguatamente iniettati nella vena caudale, non ci sarà nessun effetto sistemico sul collateralization. In questo protocollo, abbiamo iniettato monociti 2,5 milioni. Tenta di iniettare non più di 5 µ l/g di peso corporeo.
- Utilizzare la soluzione di monocito preparata sotto passo 1.1.8 contenente 2,5 milioni monociti.
- Utilizzare un ago 30g e una siringa da insulina 1 mL per l'iniezione.
- Con attenzione maneggiare il mouse, trattenere l'animale nel dispositivo di ritenuta e assicurarsi che il mouse non è danneggiato e ha spazio sufficiente per la respirazione.
- Mettere il dispositivo di ritenuta sul riscaldamento pad in modo che la coda può contattare la piastra.
- Identificare le vene di coda, che si trovano sulla parte laterale della coda.
- Girare la coda 90 °, così vena caudale appare sul lato superiore della coda.
- Disinfettare il lato di iniezione prima di iniettare i monociti.
- Tenta di iniettare la soluzione del monocito in un angolo piatto con la smussatura dell'ago rivolto verso up.
Nota: Interrompere l'iniezione se viene visualizzata la finestra di un blister, come questo è un segno di un'iniezione non riuscita. Tentare la procedura ancora più prossimalmente. - Fermare emorragia al sito di iniezione applicando leggera pressione sulla coda per circa 60 anni.
- Osservare l'animale per 30 min monitorare gli effetti collaterali sistemici e posizionare il mouse nella sua gabbia dopo l'animale ha pienamente recuperato.
5. La microscopia intravital
- preparazione
- posizionare il mouse anestetizzato il termoforo (37 ° C) per mantenere una temperatura costante e fissare le zampe in posizione con nastro adesivo.
- Disinfettare la pelle presso il sito della gamba o del fianco che viene utilizzato per la microscopia.
- La regione di interesse per una migliore maneggevolezza e per evitare interferenze con i capelli la barba.
- Asportare la pelle con un bisturi sterile e una pinzetta in un'area quadrata di 0,5 x 0,5 cm.
Nota: È importante mantenere l'area di interesse umido; in caso contrario, sarà compromessa la qualità delle immagini e dei tessuti. Soluzione di NaCl può essere utilizzata per inumidire l'area. - Collocare la gamba tra due francobolli regolabile e posizionare una copertura vetrata in cima i francobolli.
- Garantire il tessuto è bagnato ed è in contatto con il vetro.
- Inject 50 µ l rodamina destrano retrobulbar nel sistema venoso per una migliore visibilità dei vasi.
- Avviare la microscopia e regolare la posizione della gamba, se necessario.
- Impostazioni di microscopia intravital
- accendere il microscopio, computer, interfacce elettroniche e laser.
- Accendere il riscaldamento della camera di incubazione e/o riscaldamento tappa (piastra/pad) e impostare la temperatura a 37 ° C.
- Avviare il software di acquisizione. Se il microscopio è dotato di uno scanner di risonanza, selezionare questa modalità di scansione veloce.
- Aspettare fino a quando la temperatura raggiunge un livello costante (35-37 ° C)
Nota: Una temperatura stabile è importante per: (a) il mouse, che nell'ambito dell'anestesia non può controllarne la temperatura corporea e (b) evitando o almeno minimizzare drift focale. Questo potrebbe richiedere 1 h a diverse ore, a seconda delle condizioni circostanti (ad es., sistema di aria condizionata e il numero di fonti di calore in camera, incluse le persone). Se si utilizzano obiettivi di immersione, la zona di contatto tra l'obiettivo e copertura in vetro (o tessuto) è una tipica fonte di instabilità. Riscaldamento la lente con un riscaldatore oggettivo può aiutare; in alternativa, un microscopio con un sistema di autofocus è altamente raccomandato. - Selezionare una lente di ingrandimento con un apertura numeral elevata che soddisfa i requisiti di risoluzione dell'esperimento (Vedi nota alla fine di questa sezione).
- Ottimizzare le impostazioni di microscopio rispetto al guadagno, impostazioni del canale, velocità di scansione, pixel di risoluzione, profondità volume, dimensione di passaggio e in media prima di mettere l'animale da laboratorio sul palco.
- Scan in entrambe le direzioni per ridurre i tempi di acquisizione.
- Posizionare il mouse anestetizzato sul palco preriscaldati microscopio dopo il microscopio ha raggiunto condizioni stabili e le impostazioni sono state testate con l'aiuto di un manichino.
- Mettere la regione di interesse all'interno della matrice della membrana dello scantinato-come a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce brillante ed esaminare brevemente i capillari da luce ultravioletta con le impostazioni del filtro adeguato per i fluorophores applicata.
- Passare alla modalità; scansione avviare la scansione in modalità a bassa risoluzione 256x256 e migliorare guadagno e potere del laser fino a quando un segnale è osservato sul monitor.
- Focus sulla struttura di interesse. Ingrandire fino a quando tutti i dettagli sono visibili.
- Definire " avviare " e " fine " posizioni in direzione assiale.
- Interrompere la scansione.
- Definire dimensioni passo-passo (ad esempio, 0,5 µm) e il numero di piani focali (ad es., 10-20). Velocità di
- switch per la risoluzione di pixel finale (512 x 512 o 1.024 x 1.024) a seconda della velocità del movimento strutture subcellulari o celle e selezionare la scansione (scansione frequenza) che si adatta meglio ai movimenti. Bidirezionale di scansione è consigliata per fissare l'acquisizione degli stack.
Nota: Selezionare il più alto tasso di scansione di scansione che dà sufficiente qualità d'immagine. Punto tipico scanner forniscono velocità comprese tra 400 Hz e 1,4 kHz. Risonante scanner forniscono un ulteriore 8 o 12 kHz. Riducendo il numero di linee in direzione y, il tasso di scansione può essere ulteriormente aumentato (i valori tipici sono 512 x 512, 512 x 256 o 512 x 200 pixel di risoluzione). In base al rapporto segnale-rumore, si può tentare di migliorare la qualità dell'immagine aggiungendo la riga che si aggirano tra 2 e 4. In genere, l'impostazione di 512 x 200 con nessun risultato in media in un periodo di acquisizione di 18 ms in modalità bidirezionale con uno scanner di risonanza di 8 KHz; con 512 x 200 e 4 x una media, rallenta fino a 56 ms per ogni frame.
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Risultati
La microscopia intravital per l'esame del tumore e la crescita dei vasi collaterali innescato dai monociti può aiutare a rivelare nuovi aspetti in meccanismi molecolari di angiogenesi del tumore e arteriogenesi. Le cellule devono essere preparate e iniettato con cura utilizzando la procedura del protocollo. Differenze possono portare a variazioni tra singoli esperimenti. I monociti devono essere iniettati nel sistema venoso (Figura 1) per mantenere gli effett...
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Discussione
Il metodo qui descritto mette in luce lo sviluppo delle arterie collaterali, il comportamento dei monociti in questi vasi e il processo di arteriogenesi. I passaggi per l'applicazione del presente protocollo sono facili da imparare e può essere utilizzato in altri campi della scienza. Nonostante questi vantaggi, ci sono alcuni svantaggi. Per esempio, apparecchiature microscopica sono necessaria per eseguire le tecniche descritte. Come ottenere attrezzature per un esperimento è insostenibile, quindi è importante collabora...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da ELSE-Kröner-Stiftung e la SFB DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, German Research Foundation) 854 (Sonderforschungsbereich, centro di ricerca in collaborazione). Speciale grazie a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburgo, Germania, per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10% siero fetale di vitello (FCS) | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| 1% penicillina/streptomicina | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| 1mL Omnifix -F siringa per insulina | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania | ||
| Siringa da 50 ml | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germania | Siringa per iniettore 50 ml con canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 settimane, maschio, C57BL/6, topi BalbC | Charles River, Sulzfeld, Germania | ||
| Nastro adesivo | TESA SE, Amburgo, Germania | ||
| Software di acquisizione | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Fluorescenza avanzata (LAS AF); Versione: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania | 29G, 30G | |
| Piastra per colture cellulari | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | ||
| Terreno per colture cellulari | Prodotto dal nostro gruppo con singoli componenti | Medium199, 10% Siero fetale di vitello, 1% Antibiotico (penicillina/streptomicina) | |
| Centrifuga | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germania | Allegra X-15R centrifuga | |
| Crema depilatoria | Veet, Mannheim, Germania | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Agente disinfettante | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Germania | ||
| Bisturi monouso n. 10 | Feather rasoio di sicurezza Co.Ltd, Osaka, Giappone | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Pallone di Erlenmeyer | GVB, Herzogenrath, Germania | ||
| Etanolo 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Germania | ||
| Siero fetale di vitello | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Svizzera | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Codice: D-1819 | |
| Guanti | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germania | ||
| Termoforo | Labotect GmbH, Gö ttingen, Germania | Piastra calda 062 | |
| Fattore stimolante le colonie di macrofagi umani | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | SRP3110 | |
| Filtri per leucociti senza crudeltà | Incubatore per la conservazione | ||
| Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania | |||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Germania | ||
| Ketamina (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlino, Germania | ||
| Provette per la separazione dei leucociti (provette con filtro) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germania | ||
| Microscopio ottico | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germania | Axiovert 40 C | |
| LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson e compagnia, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Banco di lavoro microbiologico | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germania | Hera safe | |
| Vetrino per microscopio | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Supporto per microscopio con incubatore e unità di riscaldamento | Leica DMI 6000, Pecon, Germania | ||
| Tampone di lavaggio monocita | Prodotto dal nostro gruppo con componenti | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse retrattile | Vari | ||
| microscopi multifotoni | Leica, Wetzlar, Deutschland | Microscopio confocale Leica SP5, Cameleon, NaCl coerente | |
| (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlino, Germania | ||
| Camera di conteggio Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Germania | ||
| Obiettivo | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania | ph 7,4 | |
| sterile Penicillina/Streptomicina | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Percoll | Prodotto dal nostro gruppo con componenti singoli | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1.064 g cm-3 | |
| Soluzione Percoll | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Svezia | ||
| Pipette | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | 10µ L/100µ L/200µ L/1000µ L | |
| Pipette sierologiche | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Teste di pipettaggio | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | ||
| Provetta in polistirolo | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Bilancia | Gamma Delta Mettler PM4800, Mettler-Toledo GmbH, Gie it, Germania | ||
| Unità di aspirazione | Integra bioscience, Fernwald, Germania | Vacusafe comfort | |
| Forbici chirurgiche | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Soluzione di tripano blu 0,4 % | Sigma Aldrich, Amburgo, Germania | ||
| Tubi con tappo | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xilazina (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Dü sseldorf, Germania |
Riferimenti
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