Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.
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Articolo metodologico
In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono le centrali elettriche delle cellule e producono energia cellulare sotto forma di ATP. La disfunzione mitocondriale contribuisce all'invecchiamento biologico e una vasta gamma di disturbi tra cui malattie metaboliche, sindromi di invecchiamento precoce e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP). Mantenimento della salute mitocondriale dipende la biogenesi mitocondriale e la liquidazione efficiente dei mitocondri disfunzionali attraverso mitophagy. Metodi sperimentali per rilevare con precisione l'autofagia/mitophagy, soprattutto nei modelli animali, hanno state difficili da sviluppare. Recenti progressi verso la comprensione dei meccanismi molecolari di mitophagy ha permesso lo sviluppo di tecniche di rilevamento del romanzo mitophagy. Presentiamo il versatile diverse tecniche per monitorare mitophagy in cellule umane, Caenorhabditis elegans (ad es., Rosella e ceppi DCT-1 / LGG-1) e topi (mt-Keima). Una combinazione di queste tecniche di rilevamento mitophagy, inclusa la valutazione inter-specie, migliorerà l'accuratezza delle misurazioni mitophagy e portare a una migliore comprensione del ruolo della mitophagy nella salute e nella malattia.
Introduzione
Mitophagy è essenziale per manutenzione mitocondriale. I mitocondri si intersecano molteplici vie di segnalazione delle cellule e sono universale degli organelli sub-cellulari responsabili della produzione di energia cellulare, metabolismo cellulare e calcio omeostasi1,2,3, 4. i mitocondri costantemente esperienza sfide da fonti endogene ed esogene, come specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sostanze tossiche mitocondriale, rispettivamente, che portano alla generazione dei mitocondri disfunzionali e "invecchiati". Accumulazione dei mitocondr....
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Protocollo
Animali (topi maschi e femmine) nati e cresciuti in un impianto di animale accreditati, in conformità e approvazione del Comitato di uso e cura degli animali di NIH. Metodi di eutanasia devono essere coerente con tutte le normative nazionali e istituzionali.
1. rilevamento di Mitophagy in cellule umane
- Rilevamento di mitophagy utilizzando mt-Keima plasmide
Nota: La proteina di Keima, fusa ad un segnale di bersaglio di mitocondri, semplificato come mt-Keima, ha dimostrato utile per il rilevamento di mitophagy in vivo . Mt-Keima è una proteina fluorescente di pH sensibili raziometrici che esibisce verde ....
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Risultati
Rilevamento di Mitophagy in cellule umane:
Utilizzando la procedura qui presentata, umane cellule HeLa transfected con mt-Keima plasmide. Le cellule sane hanno dimostrato una ben organizzata rete mitocondriale (GFP, 488 nm) con poche incidenze di mitophagy (RFP, 561 nm). Tuttavia, le celle pretrattati con un mitocondriale disaccoppiante FCCP (30 µM per 3 h) ha esibito un aumento profondo mitophagy incidenza (Fi.......
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Discussione
Misurazione accurata di mitophagy è tecnicamente impegnativo. Qui, abbiamo presentato diverse tecniche robuste che consentono entrambi rilevazione qualitativa di mitophagy e quantificazione dei livelli di mitophagy nei modelli sperimentali di laboratorio più comuni.
Acquisire dati replicabili, un disegno sperimentale con almeno tre ripetizioni biologiche è necessario. Tutti i ricercatori coinvolti nella sperimentazione e analisi devono essere accecati alle identità di gruppo sperimentale. Inol.......
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Dichiarazioni
Il laboratorio di Bohr ha CRADA accordi con ChromaDex e GlaxoSmithKline.
Ringraziamenti
Ringraziamo Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle per aver condiviso il plasmide Keima mt e mt-Keima integrato cellule Hela. Ringraziamo Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau per la lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale di NIH (VAB), Istituto nazionale su invecchiamento, nonché un 2014-2015 e 2016-2017 NIA intra-laboratorio concedere (FEP, VAB). FEP è stata sostenuta da HELSE SOR-OST RHF (progetto No: 2017056) e il Consiglio di ricerca di Norvegia (progetto No: 262175).
AUTORE DI CONTRIBUTI:
FEP progettato il manoscritto ed elaborato i....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione del DNA | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | terreno privo di siero |
| mtKemia plasmide: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| Anticorpo LAMP2 (coniglio) | NOVUS | ||
| capra-anti-coniglio con lunghezza d'onda 568 nm di proteina fluorescente rossa (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 colorante |
| capra-anti-topo con lunghezza d'onda 488 nm di proteina fluorescente verde (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 colorante |
| prolungare l'antidissolvenza dell'oro con DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| Piastra a 6 pozzetti | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| vetrino a camera a 4 pozzetti | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F Piastra a 96 pozzetti | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B anticorpo coniglio | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA anticorpo | Progen Biotechnik | #anti-DNA monoclonale di topo, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | mezzo di montaggio antisbiadimento con DAPI |
| IN Analizzatore cellulare (lettore fluorescente) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Analizzatore cellulare 2200 | |
| Eclipse TE-2000e Microscopio confocale | Nikon | #TE-2000e | |
| Software di colocalizzazione | Volocity | #Volocity 6.3 | software alternativo Zeiss ZEN 2012 |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| terreno per colture cellulari | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle | |
| media (10.000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Incubatore per colture cellulari | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Incubatore | |
| Microscopio per epifluorescenza | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| fotocamera | Olympus | Olympus DP71 | |
| Software confocale Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | ||
| delle | Zeiss | ZEN 2012 | |
| Analisi | Image J | , ecc | di |
| analisi https://imagej.nih.gov/ij/ statistica | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | Materiale del pacchetto software GraphPad Prism | |
| per realizzare un plettro a vite senza fine | Surepure Chemetals | #4655 | Il plettro è realizzato in filo di iridio calibro 30 90% platino 10% |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Richiesta materiale a Tavernarakis Nektarios | a 20 ° C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Richiesta materiale a Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Richiesta materiale a Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Richiesta materiale a Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed:: LGG-1 | Richiesta di materiale a Tavernarakis Nektarios | ||
| Soluzione di paraquat | vedere dati supplementari per la preparazione | ||
| Tampone M9 | vedere dati supplementari per la preparazione | ||
| Tampone M9-levamisolo | vedere dati supplementari per la preparazione | ||
| Vetrini per microscopio e vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Pinze chirurgiche | STERIS Animal Health | 19 pezzi Canine Spay Pack Economy | |
| Forbici chirurgiche | STERIS Animal Health | 19 pezzi Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS deve essere diluito a 1x PBS utilizzando lo shaker ddH2O |
| Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tavolo orbitale piccolo Agitatore per piattaforma all'aperto Pacchetto Un | |
| tampone di agarosio al 2% | vedere i dati supplementari per la preparazione | ||
| Lame Vibroslice | World precision instruments | #BLADES-2 | lama a lama singola |
| piastra metallica MSC | #78803988 | 0,012 pollici di spessore x 6 pollici di larghezza x 12 pollici di lunghezza, 430 fogli di acciaio inossidabile | |
| Triton X-100 | detergente | ||
| Metil viologeno dicloruro idrato | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubatrice per nematodi Incubatrice | AQUALYTIC | per mantenere 20 ° C | |
| Stereomicroscopio da dissezione | Olympus | SMZ645 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | AxioObserver Z1 | Per nematodi (fase 2) |
| microscopio a epifluorescenza | Zeiss | AxioImager Z2 | Per nematodi (fase 2) |
| reticolante UV | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | Sorgente di luce UV; 356 nm |
Riferimenti
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
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Ristampe e permessi
