Forniamo un protocollo per l'imaging di pH intracellulare di una stirpe delle cellule staminali epiteliali in vivo tessuto ovarico di Drosophila . Descriviamo i metodi per generare mosche transgenici che esprimono un biosensore pH, mCherry::pHluorin, immagine biosensore usando la formazione immagine di fluorescenza quantitativa, generare curve standard e convertire i valori di intensità di fluorescenza per valori di pH.
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Articolo metodologico
Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
Variazioni di pH intracellulare (pHi) svolgono i ruoli importanti nella regolazione di molte funzioni cellulari, compreso il metabolismo, proliferazione e differenziazione. In genere, pHi dinamiche sono determinati in cellule coltivate, suscettibili di misurazione e manipolando sperimentalmente pHi. Tuttavia, il recente sviluppo di nuovi strumenti e metodologie ha permesso di studiare pHi dinamica all'interno del tessuto intatto, vivo. Per la ricerca di Drosophila , uno sviluppo importante è stata la generazione di una linea transgenica che trasportano un biosensore pHi, mCherry::pHluorin. Qui, descriviamo un protocollo che usiamo abitualmente per formazione immagine dal vivo della drosofila ovarioles per misurare pHi del lignaggio di cellule staminali (FSC) epiteliali del follicolo in mCherry::pHluorin linee transgeniche wild-type; Tuttavia, i metodi descritti qui possono essere facilmente adattati per altri tessuti, compreso i dischi di ala e dell'epitelio dell'occhio. Descriviamo tecniche per esprimere mCherry::pHluorin del lignaggio di FSC, mantenimento del tessuto ovarico durante il live di imaging e acquisire ed analizzare le immagini per ottenere i valori di pHi.
Introduzione
Studi recenti hanno rivelato un ruolo per le modifiche a pHi durante cellulari displasia e differenziazione in vivo1,2. Questi studi hanno trovato che pHi è notevolmente coerenti in cellule dello stesso tipo nella stessa fase di differenziazione, ma che cambia come le cellule di transizione da una fase a altra. In alcuni casi, bloccando le modifiche a pHi parzialmente sconvolge la differenziazione, suggerendo che il cambiamento a pHi non è solo una conseguenza di cambiamenti nel destino della cellula ma invece aiuta a promuovere il cambiamento nel destino della cellula, magari attraverso effetti sulla....
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Protocollo
Nota: per misurare pHi del lignaggio di FSC, noi calcolare il rapporto di intensità di fluorescenza di pHluorin a mCherry in FSCs, PFC e le cellule del follicolo in condizioni fisiologiche e convertire i rapporti in valori di pHi con standard curve di calibrazione per ogni cella tipo 7. Primi, live imaging esperimenti sono effettuati per misurare l'intensità di fluorescenza di pHluorin e mCherry in germaria dissecato in un tampone contenente NaHCO 3, che simula condizioni fisiologiche 1 , 7. prossime, standard curve sono generate dalla misura pHluorin e mCherry intensità ....
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Risultati
Qui abbiamo descritto il processo di misurazione pHi nell'epitelio del follicolo, che prevede diversi passaggi. In primo luogo, le ovaie vengono sezionate da mosche del genotipo appropriato utilizzando strumenti per dissezione e montaggio (Figura 1). Le ovarioles sono quindi Imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e le immagini vengono analizzati per ottenere misurazioni di pHi. Per ogni immagine, i tipi di cellule di interesse vengono .......
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Discussione
Qui, descriviamo un metodo per misurare il pHi di cellule del lignaggio di FSC all'interno del tessuto wildtype. Questo protocollo è stato sviluppato e perfezionato negli ultimi cinque anni, da quando abbiamo iniziato a studiare pHi in tessuto ovarico di Drosophila . Durante quel tempo, il protocollo è stato utilizzato con successo da più ricercatori nel nostro laboratorio e su almeno quattro diversi filatura disc e microscopi a scansione laser. La riproducibilità della nostra osservazione originale, che pHi aum.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Bryne Ulmschneider per i contributi per il protocollo e Diane Barber per suggerimenti sul manoscritto. Quest'opera è stata finanziata da un Istituto nazionale di sovvenzione di salute GM116384 a T.G. Nystul e D.L. Barber.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::p Hluorin[1] | |||
| y1 w*; P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucosio | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Utilizzare per fare KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Utilizzare per fare KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Coniugato | Thermo Fisher Scientific | C21421 | Diluizione 0,25 mg/ml |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strumenti di dissezione e montaggio | |||
| 2 Dumont Pinze in acciaio inox (misura 5) | Thermo Fisher Scientific NC9473431 | ||
| 2 aghi per siringa calibro 23 Piastra | in vetro Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Grasso per vuoto | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 vetrini da 40 mM | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Vetrini coprioggetti rotondi, diametro 12 mm, spessore 0,13-0,16 mm | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| Camera di montaggio 3D | manufactured.stl | e .ipt files per stampante 3D inclusi come file supplementari | |
| Name | Company< | strong>Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| Misuratore di pH | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Modello: Accumet AB15 |
| Microscopio di dissezione | Olympus Corporation | 0H11436 | Modello: Microscopio confocale SZ2-ST |
| confocale | Leica Biosystems | SP5 o SP8 con obiettivo 40& con un'apertura numerica di 1,3 |
Riferimenti
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G.
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Ristampe e permessi
