Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Sommario

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.

Abstract

Lo svuotamento del potenziale di membrana mitocondriale (MMP, ΔΨm) è considerato l'evento più iniziale nella cascata apoptotica. Essa si verifica anche davanti le caratteristiche nucleari apoptotiche, tra cui la condensazione della cromatina e rottura del DNA. Una volta che i crolli MMP, apoptosi avvierà irreversibilmente. Una serie di coloranti cationici lipofilici può passare attraverso la membrana cellulare e di aggregazione all'interno della matrice del mitocondrio e servire da indicatore di fluorescenza per valutare il cambiamento MMP. Come uno dei sei membri di Cl^– famiglia canale intracellulare (clicca), CLIC4 partecipa al processo di apoptosi cellulare principalmente attraverso la via mitocondriale. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare MMP, attraverso il monitoraggio della fluttuazione di fluorescenza di rodamina 123 (Rh123), attraverso il quale studiamo l'apoptosi indotta da atterramento di CLIC4. Discutiamo i vantaggi e i limiti dell'applicazione di scansione laser confocale e microscopio a fluorescenza normale in dettaglio e anche confrontarlo con altri metodi.

Introduzione

Rh123 è un colorante cationico di fluorescenza, che serve come un indicatore per il potenziale transmembrana. Rh123 è in grado di penetrare la membrana cellulare e inserendo la matrice mitocondriale a seconda della differenza di potenziale di dentro e fuori la membrana¹. Apoptosi porta a danni di integrità della membrana mitocondriale. Il poro di transizione di permeabilità (MPTP) di mitocondrio per aprire e condurre al collasso di MMP, che a sua volta provoca il rilascio di Rh123 verso l'esterno dei mitocondri. Infine, verrà rilevati più forte segnale di fluorescenza verde con microscopio a fluorescenza. È ben documentato che lo svuotamento de....

Protocollo

1. cultura e transfezione delle cellule

1. Coltura cellulare
   Nota: HN4, una linea cellulare HNSCC, è stato derivato dai pazienti con HNSCC¹⁴.
   1. Cellule di HN4 cultura in di Dulbecco per volta supplementato Eagle (DMEM, glucosio di 4,5 g/L) con 10% siero bovino fetale e gli antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO₂.
2. Transfezione delle cellule
   1. Un giorno prima di transfezione, piastra 5x10⁵ celle in 2 mL/bene di terreno di coltura senza antibiotici in piastre da 6 pozzetti.

Risultati

Nello studio presente, Rh123 è stato applicato per rilevare le MMP. Inizialmente, le cellule HN4 sono state coltivate per la fluorescenza seguente esperimenti di colorazione. Pinzette sono state utilizzate per mettere il coprioggetti circolari sul fondo di piastre da 6 pozzetti (Figura 1A). Le lamelle sono state rivestite con polilisina per 5 min e poi la polilisina rimosso via pipettatore (Figura 1B

Discussione

È ben documentato che Cl⁻ canali sono essenziali per mantenere l'emostasi dell'ambiente interno e giocano un ruolo importante nella proliferazione cellulare e apoptosi^15,16. Quindi, comprendere la relazione tra intervento di targeting canale ionico e apoptosi è di grande necessità e importanza di trovare un migliore approccio terapeutico per vari cancri¹⁷. Mitocondri mantengono il normale stato biologico di una cella e la sua fu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule HNSCC	ATCC	CRL-3241
Polilisina	Thermo Fisher Scientific	P4981
SiRNA specifico per CLIC4 umano	Biomics	NM_013943	(numeri di accesso, NM_013943; corrispondenti alla sequenza di cDNA 5-GCTGAAGGAGGAGGAAAGA-3) e siRNA criptato (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) sono stati progettati e ottenuti da Biomics Company
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I Siero Ridotto Medium, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco' Eagle medium modificato (DMEM, 4,5 g/L glucosio)	Gibco	11965-084
Siero fetale bovino, qualificato, Australia Origin	Gibco	10099141
Soluzione di tripsina-EDTA	Beyotime	C0201
Antibiotico-Antimicotico, 100X	Gibco	15240062
Microscopia confocale a scansione laser	Leica Microsystems GmbH	LEICA. SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Microscopio invertito	Nikon	N/A
Metaflour, V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A
applicazioni Leica, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft Office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
Camera cellulare Attofluor	Thermo Fisher Scientific	A7816

Suite di