Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono leucociti maturi che servono un ruolo fisiologico critico come fagociti professionali in grado di cancellare una varietà di particelle. Normalmente, BMDMs sono limitati dal sistema nervoso centrale (SNC), ma a seguito di un infortunio, essi possono facilmente infiltrarsi. Una volta all'interno il tessuto danneggiato del CNS, BMDMs sono il tipo di cellula primaria responsabile per la liquidazione del pregiudizio-derivato di detriti cellulari, tra cui grandi quantità di residui del myelin ricca di lipidi. Le ramificazioni neuropathological della fagocitosi BMDM infiltrazione e mielina detriti all'interno del SNC sono complesse e non ben compreso. I protocolli descritti qui, consentono lo studio diretto in vitro di BMDMs nel contesto della lesione dello SNC. Copriamo murino BMDM isolamento e cultura, preparazione di detriti di mielina e saggi per valutare la fagocitosi di detriti BMDM della mielina. Queste tecniche producono risultati quantificabili robusti senza bisogno di attrezzature specializzate significativa o materiali, eppure possono essere facilmente personalizzate per soddisfare le esigenze dei ricercatori.
Introduzione
Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono un importante collegamento tra il sistema immunitario innato e adattivo. Come antigene che presenta le cellule (APC), possono comunicare con i linfociti tramite entrambi presentazione dell'antigene e rilascio di citochine1,2,3. Tuttavia, come fagociti professionali, la loro funzione primaria è di eliminare gli agenti patogeni, le cellule invecchiate e detriti cellulari1,4. A seguito di una ferita del midollo spinale (SCI), notevoli quantità di residui del myelin viene g....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I metodi descritti qui e nella sezione 2 sono stati approvati dalla Florida State University istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e segue le linee guida stabilite in Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8° edizione . Tutti gli animali utilizzati in questo in questo protocollo sono di casa in una struttura di animali di laboratorio dedicato fino all'utilizzo. Nessuna sperimentazione in vivo è stato eseguito prima del sacrificio. Numero di animali era basate su necessità sperimentali utilizzando media delle celle e collezioni di mielina come guida al fine di ridurre al minimo l'utilizzo.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Trattamento di BMDMs con CFSE etichettato residui del myelin dovrebbe produrre chiaro internalizzazione (Figura 2). Mentre un tempo di 3 ore di interazione è sufficiente per BMDMs a fagocitare abbastanza residui del myelin aggiunto per rilevamento affidabile a valle, accumulo intracellulare può essere osservata con un minimo di 1 ora di interazione. Tuttavia, alcuni residui del myelin possono ancora essere presenti sulla superficie delle cellule dopo il lavaggio. Questo potrebbe essere a cau.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Le procedure descritte qui utilizzano entrambi appena isolato residui del myelin CNS grezza e macrofagi primari derivanti dal midollo osseo. Per ridurre le spese di animale, che si consiglia di entrambi i cervelli e le cellule del midollo osseo raccolte da ogni mouse al momento del sacrificio. Due ricercatori lavorano insieme possono preparare contemporaneamente entrambi i materiali. In alternativa, cervelli possono essere conservati a-80 ° C in PBS completati con antibiotici prima dell'isolamento di detriti di mielina. .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist presso la FSU College of Medicine per tutta la sua opera nella produzione di video, l'editing e Voice-over.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | Alto glucosio con L-glutammina, piruvato di sodio |
| Penicillina-Streptomicina Soluzione | Corning | 30-002-CI | 100X Siero |
| vitello appena nato (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | Stati Uniti Origine |
| NCTC clone 929 [L cellula, L-929, derivato del ceppo L] | ATCC | CCL-1 | L929 Linea cellulare di preparazione di terreni condizionati Piastre per |
| colture cellulari a 24 pozzetti | VWR | 10062-896 | |
| Piatto per colture cellulari | Greiner Bio-One | 639960 | Polistirina, 145/20mm |
| Kit di proliferazione cellulare CFSE | Thermo Fisher | C34570 | DMSO per la ricostituzione |
| Fornito Fluoro-gel con Tris Buffer | Scienze della microscopia elettronica | 17985-11 | |
| Olio rosso O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materiali | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polipropilene, 38,5 mL, 25 x 89 mm |
| Rotore per ultracentrifuga SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti, Secchio oscillante, |
| Omogeneizzatore rotativo portatile | Fisher Science | 08-451-71 |
Riferimenti
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
