In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono un importante collegamento tra il sistema immunitario innato e adattivo. Come antigene che presenta le cellule (APC), possono comunicare con i linfociti tramite entrambi presentazione dell'antigene e rilascio di citochine^1,2,3. Tuttavia, come fagociti professionali, la loro funzione primaria è di eliminare gli agenti patogeni, le cellule invecchiate e detriti cellulari^1,4. A seguito di una ferita del midollo spinale (SCI), notevoli quantità di residui del myelin viene generato dai oligodendrocytes morente, il tipo di cellula responsabile della CNS assone mielinizzazione⁵. Noi ed altri abbiamo indicato che la liquidazione dei residui del myelin è principalmente la responsabilità di infiltrazione del BMDMs^5,6,7. Tuttavia, all'interno di ferita del midollo spinale engulfment siti di residui del myelin è stato suggerito di spostare queste cellule antinfiammatorie normalmente verso un stato pro-infiammatorio^5,8,9. Come mediatori chiave della neuro-infiammazione nel midollo spinale danneggiato, BMDMs sono obiettivi clinici importanti.

Al fine di studiare l'influenza della BMDMs nel midollo spinale danneggiato, abbiamo sviluppato un modello in vitro per studiare direttamente come BMDMs rispondere a residui del myelin. Per migliorare la rilevanza biologica, sia primario BMDMs murino e residui del myelin appena isolate sono utilizzati in queste indagini. Come tale, i metodi presentati qui dettaglio anche l'isolamento e coltura di BMDMs murino primario e derivato una tecnica gradiente di saccarosio modificate usata per isolare murino CNS mielina detriti^10,11,12. Residui del myelin possono essere prontamente etichettato con un colorante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), per rilevare che l'internalizzazione di BMDMs. CFSE è adatto per questa applicazione perché è non citotossica e suoi permessi stretto spettro fluorescente Multiplexing con altri fluorescente sonde^13,14. A seguito di fagocitosi, mielina detriti i lipidi sono trasportati attraverso i lisosomi e confezionati come lipidi neutri in goccioline di lipidi intracellulari⁵. Per quantificare questo accumulo di lipidi intracellulari, presentiamo un olio rosso O (ORO) che macchia il metodo ottimizzato per l'analisi quantitativa delle immagini. Questo semplice metodo di macchiatura produce robusti risultati riproducibili e quantificazione¹⁵. Questi metodi facilitano lo studio di ritenzione di fagocitosi e del lipido di detriti della mielina con limitate attrezzature specializzate.

I metodi descritti qui e nella sezione 2 sono stati approvati dalla Florida State University istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e segue le linee guida stabilite in Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8^° edizione . Tutti gli animali utilizzati in questo in questo protocollo sono di casa in una struttura di animali di laboratorio dedicato fino all'utilizzo. Nessuna sperimentazione in vivo è stato eseguito prima del sacrificio. Numero di animali era basate su necessità sperimentali utilizzando media delle celle e collezioni di mielina come guida al fine di ridurre al minimo l'utilizzo.

Nota: Questo protocollo descrive la generazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) (sezione 1), la preparazione dei residui del myelin fluorescente contrassegnati di cervello-derivato (sezione 2), la procedura generale per l'analisi di fagocitosi di detriti della mielina (sezione 3), e la procedura generale per l'analisi di accumulazione di mielina detriti del lipido (sezione 4). Preparazione dei reagenti, cella raccolta e manipolazione, raccolta di mielina ed etichettatura e performance test dovrebbe essere completati in una flusso d'aria laminare di biosicurezza.

1. generazione dei macrofagi primari derivanti dal midollo osseo

1. Preparazione del terreno di coltura completa del macrofago (cm)
   Nota: generazione del macrofago dal midollo osseo richiede l'uso del fattore distimolazione del macrofago (M-CSF). Questa preparazione utilizza i L929 dei fibroblasti murini condizionato media come fonte di M-CSF.
   1. Generare i media di fibroblasti murini condizionato L929 dalle cellule di coltura in piastre da 145 mm con 50 mL di alto glucosio (4500 mg/L L-glucosio) Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con siero di vitello nato nuovo 5% (NCS) e penicillina/streptomicina per 7 giorni.
   2. Raccogliere media da culture in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL e centrifugare per 30 minuti a 3500 x g, 4 ° C.
   3. Filtrare i surnatanti attraverso un filtro per siringa 0,2 µm in una nuova provetta conica 50 mL. Media condizionati possa essere memorizzati a-80 ° C fino a 6 mesi.
   4. Ad alto glucosio DMEM, aggiungere 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 dei fibroblasti murini condizionata DMEM e 1% penicillina/streptomicina. Media può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi. Calda a 37 ° C prima dell'uso.
2. Raccolta di cellule del midollo osseo primario e induzione del macrofago
   Nota: Utilizzando questo protocollo un mouse genererà circa 20 milioni derivanti dal midollo osseo macrofagi (BMDMs).
   1. Eutanasia il numero desiderato di 8-10 settimana vecchi topi utilizzando le linee guida standard CO₂ asfissia seguiti da dislocazione cervicale.
   2. Sterilizzare l'animale utilizzando 70% etanolo (vol/vol): H₂O, saturando la pelliccia.
   3. Fare un piccolo taglio nell'addome e attentamente tirare indietro la pelle per rivelare il tessuto sottostante. Fare attenzione a non forare la cavità peritoneale.
   4. Rimuovere entrambi i piedini posteriori a partire dell'anca e termina alla caviglia. Posto il tessuto raccolto in una capsula Petri 100 mm contenenti fosfato sterile 5-10 mL tampone salino (PBS) completato con 1% penicillina/streptomicina.
      Nota: Quando l'elaborazione di diversi animali assicuratevi di mantenere i piatti sul ghiaccio per limitare la degradazione del tessuto.
   5. Togliere l'osso usando un bisturi muscolare e del tessuto connettivo. Solo il femore e la tibia sono utilizzati per la raccolta delle cellule, può essere scartato il perone.
   6. Esporre la cavità del midollo delle ossa raccolte tagliando una piccola sezione da ogni estremità con un bisturi.
   7. Utilizzando un ago 25g, sciacquare la cavità del midollo con 59cm in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Le ossa apparirà bianche una volta che essi sono state svuotate sufficientemente.
   8. Una volta ultimata la raccolta, agitare aspira con un ago da 18g per 30-90 s generare una sospensione unicellulare.
      Nota: Un passaggio di lisi opzionale di globuli rossi (RBC) può essere eseguita a questo punto. Recentemente è stato suggerito che il contenuto intracellulare del ferro può influenzare gli effetti di residui del myelin sopra del macrofago polarizzazione¹⁶. Per ulteriori informazioni per quanto riguarda l'inclusione di un passo di lisi RBC fare Trouplin et al. ¹⁷.
   9. Filtrare la sospensione attraverso un colino di sterile cella 70 µm in una nuova provetta conica 50 mL.
   10. Seme raccolto cellule uniformemente in piastre di coltura cellulare 145 mm contenente mL 15-20 cm. Utilizzare circa tre piastre di coltura per topo sacrificato. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO₂.
   11. Dopo 72 ore lavare le piastre una volta con PBS sterile per rimuovere le cellule non-aderenti, quindi aggiungere 15-20mL 59cm fresco. Incubare le colture per altri 4 giorni a 37 ° C, 5% CO₂. Dopo 7 giorni di cultura totale, le cellule di midollo osseo ematopoietico inizialmente isolate sarà maturo BMDMs (Figura 1).

2. generazione di residui del Myelin fluorescente contrassegnati cervello-derivato

Nota: Tutti i reagenti possono essere conservati a 4 ° C fino a 1 mese.

1. Preparazione dei reagenti di raccolta detriti mielina
   1. Preparare Tris· Soluzione tampone di cl.
      1. A 800mL di acqua distillata deionizzata H₂O (ddiH₂O), aggiungere 20 mL di 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentrazione finale di 20 mM) e 20 mL di 100 mM Na₂EDTA (concentrazione finale di 2 mM).
      2. Regolare il pH a 7,45. Regolare il volume a 1000 mL con ddiH₂O. filtro soluzione attraverso un'unità di filtrazione 0,2 µm.
   2. Preparare la soluzione di saccarosio 1m.
      1. A 100 mL di Tris· CL soluzione tampone, aggiungere 68,46 g di saccarosio. Regolare il volume a 200 mL con Tris· Soluzione tampone di cl. Filtrare la soluzione attraverso un'unità di filtrazione di 0,2 µm.
   3. Preparare 200 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).
   4. Preparare 150 mL di soluzione di saccarosio 0,83 M diluendo la soluzione di 1m con il Tris· CL 0.83:0.16 di soluzione tampone (vol/vol).
2. Raccolta di residui del myelin greggio cervello-derivato
   Nota: Il metodo di prelievo descritto qui è per l'isolamento dei residui del myelin grezza.
   1. Eutanasia, topi di 10-12 8-10 settimane di età utilizzando direttive standard di CO₂ asfissia seguite da dislocazione cervicale.
   2. Sezionare i cervelli e metterli in un piatto di 100 mm contenente 10 mL di soluzione di saccarosio 0,32 M.

3. mielina detriti test di fagocitosi

Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione di fagocitosi di residui del myelin fluorescente contrassegnati. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.

1. Preparazione delle piastre di trattamento
   1. Per ogni piastra 145mm, raccogliere BMDMs maturo in una provetta conica per centrifuga 15 mL con 5-6 mL di acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed) in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (dPBS) (pH 7.4).
      Nota: Non utilizzare tripsina in quanto può alterare lo stato di attivazione delle cellule¹⁸.
   2. Aggiungere un volume uguale di 59cm pre-riscaldato a ciascuna provetta di cellule prelevate.
   3. Centrifugare a 180 x g per 8 min 20 ° C. Scartare il surnatante.
   4. Risospendere le cellule in 59cm e conteggio.
   5. A ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti, aggiungere 1 x 10⁵ cellule in 1 mL di 59cm.
   6. Incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 24 h.
2. Analisi e trattamento di detriti di mielina
   1. Aggiungere 10 µ l di 100 mg/mL CFSE etichettato residui del myelin in ciascun pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).
   2. Incubare per 1-3 ore a 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non inghiottito.
   4. Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.
   5. Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile.
   6. Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
   7. Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.
   8. Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris ad ogni pozzetto per ridurre photobleaching.
   9. Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito.
      Nota: Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione della CFSE è 494 nm e 521 nm, rispettivamente.
   10. Dividere il numero di cellule positive CFSE per il numero di nuclei per determinare l'assorbimento di detriti di mielina relativa.
   11. Prima di formazione immagine, è possibile mantenere piastre fino a 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.

4. quantificazione dei lipidi intracellulari tramite olio rosso-O macchiatura

Nota: Di seguito è riportato il metodo di base per l'osservazione intracellulari lipidi della mielina-detriti-derivati.L'uso di CFSE etichettato residui del myelin non è raccomandato per quantificazione fluorescente di ORO macchiatura dovuto sovrapposizione spettrale. Aggiunta di altri trattamenti e condizioni sperimentali dovrà essere ottimizzata dallo sperimentatore.

1. Preparazione di soluzioni di colorazione
   1. Preparare soluzione colorante di 0,5% olio rosso-O (ORO).
      1. Lentamente aggiungere 100 mL del 100% di glicole propilenico (1,2-propandiolo) a 0,5 g di ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) continuando a mescolare.
      2. Riscaldare la soluzione a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando tutte le particelle più grandi vengono sciolti.
         Nota: non riscaldare oltre i 100 ° C.
      3. Filtrare la soluzione attraverso un pezzo di carta da filtro mentre ancora caldo in un nuovo contenitore.
      4. Consentire la soluzione di fresca durante la notte a RT. soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.
   2. Preparare la soluzione di glicole propilenico 85%.
      1. Aggiungere 85 mL di glicole propilenico 100% a 15 mL di ddiH₂O. mescolare fino misto. Soluzione può essere conservata fino a 1 anno a TA.
2. Preparazione delle piastre di trattamento
   1. Preparare una piastra a 24 pozzetti seguendo il metodo descritto nella sezione 3.
   2. Incubare a 37 ° C, 5% CO₂ per 24 h.
3. Trattamento di detriti di mielina
   1. Aggiungere 10 µ l di residui del myelin 100mg/mL ad ogni pozzetto (concentrazione finale di 1 mg/mL).
   2. Incubare per 1-3 h a 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Lavare la piastra 3 volte con PBS sterile per rimuovere residui del myelin non digerito.
      Nota: A questo punto, piastre possono sottoporsi sia fissazione immediata o 59cm fresche possono essere aggiunti e celle restituite a incubazione per i punti di tempo aggiuntivo.
   4. Aggiungere 400 µ l di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a TA.
   5. Lavare la piastra 2 volte con PBS sterile poi dirette alla macchiatura.
4. ORO di colorazione e analisi
   1. Lavare la piastra fissa 3 volte con ddiH₂O.
   2. Aggiungere 400 µ l di 100% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minuti a TA.
      Nota: questo ridurrà il riporto di ddiH₂O.
   3. Aspirare il glicole propilenico e aggiungere 400 µ l di soluzione ORO in ciascun pozzetto.
   4. Incubare per 8 min a 60 ° C.
   5. Aspirare la soluzione ORO. Quindi, aggiungere 400 µ l di 85% di glicole propilenico in ogni pozzetto e incubare per 5 minumintes a TA.
   6. Lavare la piastra 3 volte con ddiH₂O.
   7. Aggiungere 400 µ l di soluzione di Hoechst 33258 a ciascun pozzetto. Incubare per 5 min a RT, al riparo dalla luce.
   8. Lavare le piastre 2 volte con PBS sterile.
   9. Aggiungere 200 µ l di Fluoro-gel con tampone Tris in ciascun pozzetto.
   10. Celle di immagine utilizzando un microscopio in grado di epi-fluorescenza invertito. ORO possa essere imaged utilizzando un set di filtri standard Texas Red o DsRed.
   11. Quantificare ritenzione del lipido relativa determinazione della superficie ORO positiva in ogni campo di immagine e dividendolo per il numero dei nuclei.
   12. Mantenere piastre per 7 giorni a 4 ° C al riparo dalla luce.

Trattamento di BMDMs con CFSE etichettato residui del myelin dovrebbe produrre chiaro internalizzazione (Figura 2). Mentre un tempo di 3 ore di interazione è sufficiente per BMDMs a fagocitare abbastanza residui del myelin aggiunto per rilevamento affidabile a valle, accumulo intracellulare può essere osservata con un minimo di 1 ora di interazione. Tuttavia, alcuni residui del myelin possono ancora essere presenti sulla superficie delle cellule dopo il lavaggio. Questo potrebbe essere a causa di un lavaggio insufficiente o particelle non essendo completamente interiorizzate durante le prime fasi della fagocitosi.

Mentre BMDMs può interiorizzare velocemente residui del myelin, prima forma di goccioline lipidiche stainable ORO è necessaria elaborazione lisosomiale. Per illustrare, BMDMs sono state incubate con residui del myelin per 90 minuti, lavato e coltivate per ulteriori quantità di tempo prima della fissazione e colorazione (Figura 3). La figura 4 Mostra che c'è un ritardo tra l'inizio del trattamento e comparsa di lipidi neutri. Si noti anche che la ritenzione del lipido non è stabile durante la coltura. BMDMs inizierà a metabolizzare i lipidi accumulati subito dopo la formazione della gocciolina. Come tale, si consiglia di non più di 24 ore tra lavaggio lontano non inghiottito mielina detriti e fissazione di attesa.

Quantificazione di ORO zona macchiata di seguito viene illustrato il tasso del metabolismo dei lipidi della mielina in BMDMs (Figura 5). Dopo un periodo di 90 minuti interazione, cellule ritornarono in incubazione in fresco 59cm. Durante il primo periodo di inseguimento in mezzo fresco, il BMDMs metabolizzare la componente lipidica di mielina fagocitati detriti in lipidi stainable ORO neutri. Un aumento costante nell'area positiva ORO è tipico nelle ore che seguono l'interazione. Dopo 24 ore, tuttavia, il BMDMs avrà effluxed o metabolizzato una porzione significativa dei lipidi intracellulari.

Figura 1 : Rappresentante BMDM culture. Alcune cellule aderenti saranno inizialmente osservate. Il giorno 3, vengono rimossi eventuali cellule non aderenti. Dal giorno 7, si osservano macrofagi maturi derivanti dal midollo osseo. Scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Rappresentante immagini della fagocitosi di detriti Myelin BMDM Assay. Le cellule sono state trattate con 1mg/mL CFSE etichettato residui del myelin per 1 ora prima del lavaggio e la fissazione con 4% PFA. Residui del myelin interiorizzata possono essere visualizzato utilizzando il set di filtri standard GFP su un microscopio in grado di epi-fluorescente. Scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Diagramma di disegno sperimentale di olio O rosso (ORO). BMDM sono trattati con residui del myelin 1mg/mL (diluizione 1: 100) per 90 minuti, seguita da lavaggio e cultura in mezzo fresco prima della fissazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : ORO macchiatura di BMDM seguendo la mielina detriti fagocitosi. Seguente la fissazione con 4% PFA a tempo-punti indicati, BMDMs sono stati macchiati con ORO e Hoechst 33258. Immagini rappresentative per ogni punto di tempo sono indicati. Scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Analisi di immagine quantitativa di colorazione ORO. Per la quantificazione della colorazione ORO, 3 pozzi erano imaged 20 X con 5 immagini per pozzetto. Tutte le impostazioni di acquisizione di immagine erano identiche. Barre di errore = SEM. (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.