Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

Shubhendu Sen Roy; Huy Cong Xuan Nguyen; Thomas A. Angelovich; Anna C. Hearps; Diana Huynh; Anthony Jaworowski; Theodoros Kelesidis

doi:10.3791/56325

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Articolo metodologico

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

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DOI:

10.3791/56325

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12 ottobre 2017

Shubhendu Sen Roy¹ , Huy Cong Xuan Nguyen¹ , Thomas A. Angelovich²^,³ , Anna C. Hearps² , Diana Huynh¹^,⁴ , Anthony Jaworowski²^,⁴ , Theodoros Kelesidis¹

¹University of California, Los Angeles, ²Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, ³School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, ⁴Department of Infectious Diseases, Monash University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un'analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.

Abstract

Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l'aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l'interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi).

Introduzione

Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo¹^,². Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi¹^,². Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL¹^,², il meccanismo con cui HDL attenua l'inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso ³^,