Il dosaggio di ricostituzione di Organoid (ORA) per l'analisi funzionale di nicchia cellule staminali intestinale e

Sommario

Organoid intestinale culture sono stabilite da cripte interi e non consentono l'analisi di auto-rinnovamento e differenziazione in modo specifico delle cellule. Questo protocollo descrive la ricostituzione del gambo ordinato (Lgr5⁺) e cellule (Paneth), che danno luogo a organoids consentendo loro previa modificazione biochimica e genetica e analisi funzionale di nicchia.

Abstract

L'epitelio intestinale è caratterizzata da un tasso di turnover estremamente rapida. Nei mammiferi, l'intero rivestimento epiteliale si rinnova entro 4-5 giorni. Le cellule staminali adulte intestinale risiedono nella parte inferiore delle cripte di Lieberkühn, sono state stanziate dall'espressione del gene Lgr5 e preservare l'omeostasi attraverso loro caratteristico alto tasso proliferativo¹. In tutto l'intestino tenue, Lgr5⁺ cellule staminali sono mescolareate con le cellule secretorie specializzate chiamate cellule di Paneth. Cellule di Paneth secernono composti antibatterici (cioè, il lisozima e cryptdins/defensine) ed esercitano un ruolo di controllo sulla flora intestinale. Più recentemente, una funzione di romanzo è stato scoperto per cellule di Paneth, vale a dire la loro capacità di fornire supporto di nicchia di cellule staminali Lgr5⁺ attraverso diversi ligandi chiave come Wnt3, EGF e Dll1².

Quando isolato ex vivo e coltivate in presenza di specifici fattori di crescita e di componenti della matrice extracellulare, cripte intestinali intero danno luogo a longevo e autorinnovanti strutture 3D chiamato organoids che ricordano molto il cripta-villo architettura epiteliale del piccolo intestino adulto³. Organoid culture, quando stabilito da tutta cripte, consentono lo studio di auto-rinnovamento e differenziazione della nicchia staminale intestinale, senza però affrontare il contributo dei suoi singoli componenti, vale a dire la Lgr5⁺ e Cellule di Paneth.

Qui, descriviamo un nuovo approccio per il dosaggio di organoid che sfrutta la capacità di Paneth e Lgr5⁺ cellule per associare e formare organoids quando co-coltivate. Questo approccio, definito come "dosaggio di ricostituzione organoid" (ORA), consente la modifica genetica e biochimica di Paneth o Lgr5⁺ cellule staminali, seguite da ricostituzione in organoids. Come tale, consente l'analisi funzionale dei due principali componenti della nicchia staminale intestinale.

Introduzione

L'epitelio intestinale è il tessuto più rapida auto-propagarsi nel corpo dei mammiferi e, come tale, è stato oggetto di una pletora di studi finalizzati alla identificazione e caratterizzazione funzionale delle cellule staminali adulte che risiedono nella parte inferiore della cripta di Lieberkühn, stanziato dall'espressione del gene di Lgr5 e dalla canonica Wnt segnali¹. In particolare, le cellule staminali Lgr5⁺ sono affiancate e supportate da cellule specializzate di nicchia, cioè cellule di Paneth, che dipendono anche dalla segnalazione di Wnt per loro maturazione². Insieme, ques....

Protocollo

Tutte le procedure sono state fatte secondo le linee guida e le leggi locali benessere degli animali.

1. preparazione di strumenti, mezzi di coltura e piatti

1. Set di autoclave 1 di Forbici intestinali normali forbici e pinze in un contenitore sterile.
2. Posizionare un piatto di 96 pozzetti (fondo piatto) in un incubatore a 37 ° C.
3. Preparare 10 mL di terreno di coltura completa con i reagenti elencati nella tabella dei materiali.
4. Incubare la sostanza completa a 37 ° C in un bagno d'acqua.
5. Scongelare la membrana basale ricostituita collocandolo in un secchio di ghiaccio. La membrana basale ricost....

Risultati

Il dosaggio di ricostituzione organoid permette l'analisi funzionale separata dei componenti essenziali di nicchia e di cellule staminali dell'epitelio intestinale, qui ha dimostrato di piccoli RNA interferente (siRNA) del gene dell'Apc .

Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato prima cella attivata fluorescente ordinano (FACS) per separare 8000 Lgr5⁺ e 6000 cellule di Paneth da inbred to.......

Discussione

Le ORA permette la raffinata analisi funzionale dei due componenti essenziali della nicchia staminale intestinale, vale a dire Lgr5⁺ e cellule di Paneth. Questo approccio è stato impiegato in precedenza da noi e gli altri con lievi modifiche^6,10,11. Qui, presentiamo la procedura ORA come un protocollo di laboratorio riproducibile e standardizzato. Inoltre, segnaliamo sugli effetti dell'Apc downregula.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM avanzato F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Concentrazione finale: 10 mM
Penicillina/streptomicina *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Concentrazione finale: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Concentrazione finale: 10 mM
EGF murino ricombinante *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Concentrazione finale: 50 ng/ml
Noggin murino ricombinante *	Peprotech	250-38	Concentrazione finale: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Concentrazione finale: 10 µ M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Concentrazione finale: 1 µ M
R-spondina murina ricombinante *	R& Sistemi D	3474-RS-050	Concentrazione finale: 1 mg/ml
Flexitube Soluzione genica siRNA APC	Qiagen	GS11789	Concentrazione finale: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific 11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific 14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Tubi a basso legame	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* La combinazione di questi reagenti costituisce il terreno

102424 di coltura completo