Articolo metodologico

Grande Volume, illuminazione comportamentale pertinenti per optogenetica in primati Non umani

DOI:

10.3791/56330

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3 ottobre 2017

 ,  ,  , 
1McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology, 2Harvard-MIT Division of Heath Sciences and Technology, 3Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 4Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 5Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 6Media Lab and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

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Un protocollo per costruire un illuminatore penetrante di tessuto per fornire luce attraverso grandi volumi con diametro minimo è presentato.

Abstract

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Questo protocollo descrive un illuminatore di grande volume, che è stato sviluppato per le manipolazioni di optogenetica nel cervello primate non umano. L'illuminatore è una fibra ottica di plastica modificata con punta acidato, tale che la superficie di uscita della luce è > 100 volte quella di una fibra convenzionale. Oltre a descrivere la costruzione dell'illuminatore a grandi volumi, questo protocollo dettaglia la taratura del controllo di qualità utilizzata per garantire la distribuzione uniforme della luce. Inoltre, questo protocollo descrive le tecniche per inserimento e rimozione dell'illuminatore di grande volume. Strutture superficiali e profonde possono essere illuminate. Questo illuminatore di grande volume non ha bisogno di essere fisicamente accoppiato ad un elettrodo, e perché l'illuminatore è fatta di plastica, non di vetro, esso semplicemente si piegherà a circostanze quando fibre ottiche tradizionali avrebbe distrutto. Perché questo illuminatore trasporta la luce sopra volumi rilevanti relativamente al comportamento del tessuto (≈ 10 mm3) con nessun danno una maggiore penetrazione di una fibra ottica convenzionale, esso facilita studi comportamentali utilizzando optogenetica in primati non umani.

Introduzione

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Strumenti di optogenetica, che consentono un controllo preciso al millisecondo, luce-driven neuronale sono ampiamente utilizzati per lo studio funzionale fisiologia e comportamento nei roditori e invertebrati. Tuttavia, le sfide tecniche hanno limitato l'uso di optogenetica nel cervello primate non umano, che ha un volume ~ 100 volte più grandi del cervello del roditore 1.

Per facilitare gli studi optogenetica in primati non umani, un illuminatore è stato progettato per affrontare due obiettivi contrastanti: illuminazione di grande volume e penetrazione minima danni. Precedenti tentativi di affrontare uno di questi p....

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Protocollo

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Nota: tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida NIH e sono state approvate dal Massachusetts Institute di tecnologia Comitato sulla cura degli animali.

1. Illuminatore fabbricazione

  1. usare un paio di forbici taglienti per tagliare una sezione di 250 µm diametro fibra ottica di plastica che è superiore alla lunghezza desiderata illuminatore totale di almeno 10 cm.
  2. Rimuovere 15-20 cm di rivestimento in polietilene da un'estremità della fibra ottica plastica utilizzando una spogliarellista di filo di 22 calibro.
  3. Secure distale maggior parte 3-5 cm dell'estremità spogliato della fibra in....

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Risultati

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L'illuminazione di volumi di grandi dimensioni del cervello in primati non umani consente per la manipolazione di optogenetica comportamentale pertinenti. Acker et al. (2016) utilizzato questo illuminatore di grande volume con il Halorhodopsin rosso-spostato, Jaws 7 per studiare il contributo temporale del campo frontale dell'occhio (FEF) da saccadi memoria-Guida in due scimmie rhesus. In particolare, FEF neuroni sono stati iniettati con un vettore virale contenente Jaws e poi illuminati .......

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Discussione

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Mentre optogenetica strumenti sono ampiamente utilizzati per studiare la malattia e della fisiologia nei roditori, la sfida tecnica di volumi di grandi dimensioni del cervello illuminante ha limitato l'uso di optogenetica in primati non umani. Studi nelle scimmie pionieristici utilizzato densità di grande potenza della luce (~ 100 mW/mm2 a 20 W/mm2) per illuminare piccoli volumi, forse < 1 mm3e segnalati effetti comportamentali modesti con opsine eccitatorie in corteccia

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Ringraziamenti

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LCA riconosce finanziamenti da una compagnia NDSEG, il GRFP NSF e gli amici dell'Istituto McGovern. EP riconosce finanziamenti l'Harry ed Eunice Nohara UROP Fund, la classe del MIT del 1995 UROP fondo e sul fondo di UROP MIT. ESB riconosce finanziamenti dal NIH 2R44NS070453-03A1, il premio di Harvey di IET e il Premio Fondazione-Robertson della cellula formativa di New York. RD riconosce finanziamenti dal NIH EY017292. Michael Williams ha aiutato il team a organizzare e raccogliere le forniture prima delle riprese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fibra ottica in plasticaFibra ottica industrialeSK-10250 micron di diametro, linea Super Eska
SpelafiliKlein Tools1104722 calibro
Morsetto morsaWilton11104Morsetto per morsa generico per montaggio su tavolo
Pistola termica a doppia temperaturaMilwaukee8975-6570 / 1.000 ° F
Marcatore da laboratorioVWR52877
Microscopio da dissezioneVistaVision82027-156Stereomicroscopio con doppia luce a incandescenza, ingrandimento 2X/4X, disponibile da VWR
Nastro da laboratorioVWR89097-972Confezione da 4 di colore viola; tuttavia, il colore del nastro non ha importanza
Foglio di lappatura in carburo di silicioThorLabsLF5Pgrana 5 micron, confezione da 10
Foglio di lappatura in ossido di alluminioThorLabsLF3Pgrana 3 micron, confezione da 10
Foglio di lappatura in ossido di alluminioThorLabsLF1Pgrana 1 micron, confezione da 10
Foglio di lappatura in allumina calcinataThorLabsLF03Pgrana 0,3 micron, confezione da 10
Coltello a caldoFibra ottica industrialeIF37001260 Watt, portata
di ispezionedelle fibre per impieghi gravosiThorLabsFS201
ghiera opzionale in acciaio inossidabileFibra ottica di precisioneMM-FER2003SS-265265 micron
diametro interno 1 mL siringaBD14-823-30La punta Luer-lok è preferibile per ridurre il rischio di perdite, ma non è strettamente necessaria
Fibra ottica industrialeepossidica40 0005
ago smussato calibro 18 BD305180Salvietta senza lanugine da 1,5 pollici
di lunghezza (KimWipe)ThorLabsKW32disponibile da molti fornitori
Foglio assorbente della luceThorLabsBKF12
Nastro isolante3MTemflex 1700Opzionale, può sostituire altre marche / modelli
Ago affilato calibro 26 BD3051110,5 pollici di lunghezza
MicromanipolatoreSiskiyou70750000Epuò sostituire altre marche/modelli
Steretactic armKopf1460può sostituire altre marche/modelli
Occhiali di sicurezza laserKenTeKKCM-6012devono essere selezionati in base al colore del laser utilizzato, esempio fornito qui
Laser o altra sorgente luminosavortranStradus 473-50esempio di laser blu
Sfera di integrazioneThorLabsS142CMisuratore di potenza collegato, disponibile anche da ThorLabs, articolo #PM100D
camera di registrazione UltemCrist instrument company6-ICO-J0Personalizzato con tacca di allineamento
Microdrive a torre con morsettiNANDRTBL-CMS
Tubo guidapersonalizzatoN/ARealizzato con ago spinale (BD) calibro 25 o tubo smussato
Sistema di driver NANNANNANDrive
Design della griglia personalizzatopersonalizzatipersonalizzati disponibili su richiesta
Pinze smussateFischerScientific08-875-8Apinze smussate generiche in acciaio inossidabile
Calibri digitaliNeiko01407ADisponibile su amazon.com. È possibile selezionare un calibro a risoluzione più fine per misurazioni più precise.
Cavo patchThorLabsFG200LCC-customQuesto è un esempio dei tanti possibili cavi patch. Finché il diametro della fibra è inferiore o uguale al diametro della fibra dell'illuminatore di grande volume e finché i connettori si interfacciano, qualsiasi cavo patch (vetro o plastica, acquistato dal fornitore o prodotto in laboratorio) va bene per questa applicazione.
Cappucci antipolvere in plastica trasparenteThorLabsCAPFConfezione da 25
manicotti di accoppiamento divisi in ceramicaPrecision Fiber Products, Inc.SM-CS1140S
plastica , piani

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optoge....

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Large Volume IlluminatorPlastic Optical FiberEtched TipLight DistributionFiber ConstructionSterilization ProcedureMicrodrive AttachmentBehavioral Studies

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