Articolo metodologico
Questo protocollo serve come uno schema per istituire un sistema funzionale di Tet-ON in linee cellulari del cancro e la successiva utilizzazione, in particolare per studiare il ruolo di proteine derivati da cellule tumorali nel reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale.
siRNA e abbattere shRNA-mediata di metodi (KD) di regolazione dell'espressione genica sono strumenti preziosi per capire la funzione genica e proteica. Tuttavia, nel caso che il KD della proteina di interesse ha un effetto letale sulle cellule o l'effetto atteso di KD è dipendente dal tempo, incondizionati KD metodi non sono adatti. Sistemi di condizionale sono più adatte in questi casi e sono state oggetto di grande interesse. Questi includono sistemi di sovraespressione ecdisone-inducibile, citocromo P-450 induzione sistema1, e la tetraciclina regolato sistemi di espressione genica.
Il sistema di espressione del gene di tetraciclina regolamentato consente un controllo reversibile l'espressione della proteina di induzione dell'espressione di shRNA in presenza di tetraciclina. In questo protocollo, vi presentiamo un progetto sperimentale utilizzando sistema Tet-ON funzionale in linee cellulari tumorali umane per condizionale regolazione dell'espressione genica. Dimostriamo quindi l'uso di questo sistema nello studio dell'interazione delle cellule-monociti del tumore.
Macrofagi tumore associato (TAMs) contribuiscono allo sviluppo del tumore, promuovendo la crescita del tumore, metastasi e che regolano la risposta immunitaria2. Le cellule tumorali infiammatorie monociti recluta, che infiltrano il tumore e differenziano in pro-cancerogeno TAMs3. Infiltrazione del tumore con TAMs correla con risultato clinico difficile ed è stato collegato al ruolo immunosopressivo di macrofagi4,5. Tuttavia, i meccanismi del reclutamento dei macrofagi di tumore non sono ben esplorati e una migliore comprensione delle vie coinvolte è cruciale per ....
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La sezione di protocollo che utilizza monociti umani ottenuti dai volontari sani segue le linee guida del comitato etico di bambini Ospedale Los Angeles umana ricerca ed è stata approvata dal comitato di revisione istituzionale sotto il materiale umano Numero di protocollo: CCI 08-00208.
1. preparazione di linee cellulari del cancro con tetraciclina-regolato shRNA espressione
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Tre sequenze di shRNA sono stati testati per il più efficiente KD di PAI-1. Per questo, sequenze shRNA contro PAI-1 e uova strapazzate (tabella 1) sono stati clonati nel vettore di espressione di Tet-pLKO-puro seguendo il protocollo descritto in precedenza. La linea di cellule di fibrosarcoma HT-1080 era stabilmente trasfettata con costrutti generati e le cellule sono state trattate con doxiciclina per 3 giorni. L'espressione di PAI-1 è stata verificata mediante Western b.......
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Composto da una varietà di tipi cellulari, la TME è cruciale per lo sviluppo del cancro. Per accertare le condizioni di crescita ottimali, le cellule tumorali attraggono i monociti attraverso la secrezione di fattori chemiotattici. Qui presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo di reclutamento di monociti di cellule tumorali in vitro. A tale scopo, viene utilizzata una combinazione di sistema di espressione genica viscoelastica, purificazione dei monociti umani primari e come esempio di un test di migr.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Gli autori desidera ringraziare Jacqueline Rosenberg per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da l'US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health con una sovvenzione di YA DeClerck (concedere 5R01 CA 129377) e la Fondazione di Martell TJ. Kubala MH è il destinatario di un premio di sviluppo di carriera di ricercatrice dell'Istituto di ricerca Saban a bambini Hospital Los Angeles.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tet-pLKO-puro vettore lentivirale | Addgene | 21915 | |
| FBS (senza tetraciclina) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Kit di arricchimento di monociti umani | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel e PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chimicamente Competente E. coli | Thermo Fisher Scientific C737303 | ||
| Set di coloranti Hema 3 per colorazione Wright-Giemsa | Protocollo | 123-869 | |
| cellule HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Enzima di restrizione XhoI | NEB | R0146S | |
| Ligasi | NEB | M0202S Tampone | |
| ligasi | NEB | M0202S | |
| EDTA 0,5 M soluzione | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0,1% Soluzione di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Acetato di sodio | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Butirrato di sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μ M filtri per siringhe | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(idrossimetil)amminometano (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| ditioeritritolo (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| etanolo (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| triptone | Amresco | J859-500g | |
| estratto di lievito | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillina | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-idrossietil)-1-piperazineacido etansolfonico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromicina | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| doxiciclina iclilato | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Supporto permeabile per piastra a 24 pozzetti con 8.0μ m Membrana in PET trasparente | Becton Dickinson | 353097 | |
| Albumina di siero bovino | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Applicatore con punta in cotone | Medline | MDS202000 | |
| Protocollo Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Olio da immersione, alta viscosità | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillina Streptomicina | Gibco | 15140122 |
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