Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organi-on-chip sono rapidamente emergendo come una nuova e promettente classe di in vitro modelli di tessuto. ¹ in questi modelli, le cellule sono coltivate all'interno di dispositivi microfluidici che sono progettati in modo tale che imitano il microambiente fisiologico di quelle cellule. ^{1 , 2} il risultato più realistico comportamento fisiologico o patologico di quelle cellule che può essere previsto dai modelli convenzionali in vitro del design semplice e funzione di base. ^{3 , 5 , 6} inoltre, organi-on-chip forniscono un migliore ambiente controllabile rispetto ai modelli in vivo e può incorporare sia sani che malati dei tessuti di origine umana per replicare fedelmente la patologia e fisiologia umana. I progressi recentemente riassunti nello sviluppo di sangue – cervello barriere su chip (BBBs-on-chip) mostrano che il campo sta rapidamente muovendo in avanti. ⁷

Un altro vantaggio di organi-on-chip è che essi consentono un monitoraggio in tempo reale e continuo del tessuto coltivato all'interno del dispositivo di microscopia, le analisi biochimiche on-line e sensori integrati. ^{1 , 2} ad esempio, la misura resistenza elettrica transendoteliale o transepiteliale (TEER) è un metodo potente per il monitoraggio non invasivo lo sviluppo e la rottura della barriera-formando tessuti. ^{8 , 9 , 10} TEER è la resistenza elettrica attraverso una barriera cellulare ed è quindi indicativo della permeabilità e l'integrità della barriera. ¹⁰ in organi-on-chip, barriere cellulari sono generalmente coltivate su una membrana che separa due canali fluidici, che rappresenta l'apicale e basolaterale scomparti di quel tessuto barriera. In questi chip, TEER misurazioni possono essere effettuate comodamente con elettrodi inseriti a Monte e a valle dei due canali. ^{3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} tuttavia, inserimento manuale e reinserimento degli elettrodi può facilmente causare errori di posizionamento e quindi variazioni nella resistenza misurata come ad esempio le differenze nella resistenza di percorsi più lunghi o più brevi tramite microcanali sono significative rispetto alla resistenza della barriera delle cellule. ¹⁶ per eliminare errori di reinserimento, dispositivi con elettrodi integrati sono stati proposti. Tuttavia, la maggior parte di questi elettrodi integrati blocca la vista quando si ispeziona le colture tissutali^{17,18,19,20,21} e/o richiedere specializzato Cleanroom processi per la fabbricazione. ^{17 , 22}

Il dispositivo di organo-on-chip descritto in questa pubblicazione, in primo luogo applicata in una precedente pubblicazione,¹⁶ combina la stabilità degli elettrodi integrati con visibilità sulla strato delle cellule misurata e montaggio facile. La progettazione e la fabbricazione di questo chip è raffigurato nella Figura 1. In breve, questo dispositivo è costituito da due parti di polidimetilsilossano (PDMS) con impronte di canale che sono legati insieme privo di perdite con una membrana di policarbonato con 0,4 µm pori in mezzo. Quattro elettrodi di platino filo inseriti e fissati in posizione con un fotocurabili adesivo ben di fuori della zona di coltura. Tutti questi passaggi di fabbricazione può essere condotta con apparecchiature di laboratorio generale, senza la necessità di un ambiente di camera bianca. In cima a questo, sei misure di impedenza possono essere fatto utilizzando questi quattro elettrodi, consentendo in tal modo isolamento diretto di TEER misurato, indipendente della resistenza dei microcanali che conduce fino alla sezione trasversale e riducendo al minimo l'influenza di variazioni non biologiche nel sistema come (ri) errori di inserimento. ¹⁶

Per mostrare l'applicabilità di questo dispositivo e le misure dirette di TEER, che emato - encefalica (BBB) è stata replicata in questo chip. Questa barriera biologica è costituito da cellule endoteliali specializzate e regola il trasporto tra sangue e cervello per fornire l'omeostasi del cervello. ^{23 , 24} per simulare la BBB, il canale superiore del dispositivo microfluidico è stato allineato con le cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane dalla linea cellulare hCMEC/D3 (gentilmente fornito dal Dr. P.-O. COURAUD, INSERM, Paris, France). ²⁵ il metodo proposto è, tuttavia, più in generale applicabile a qualsiasi dispositivo di organo-on-chip con due scomparti, consentendo la determinazione diretta di TEER facilmente utilizzando integrato elettrodi.

In questo manoscritto, in primo luogo il processo di fabbricazione del dispositivo organo-on-chip con elettrodi integrati è descritto. Avanti, la procedura di semina e la cultura delle cellule endoteliali cerebrali all'interno del dispositivo è spiegato, così come le misure di TEER su chip. Nella sezione risultati, misurazioni rappresentative TEER sono mostrati e trattamento dei dati è chiarito. Infine, la funzione di barriera della BBB-on-chip, monitorato durante 3 giorni, si presenta, mostrando l'applicabilità del dispositivo presentato e metodi per monitorare TEER.

1. fabbricazione del dispositivo organo-on-chip

1. fare una replica PDMS di uno stampo con i disegni di canale, fabbricato utilizzando tecniche standard di fotolitografia e ottenere le parti PDMS del chip microfluidici.
   1. Pesare circa 27 g PDMS base agente e agente indurente 2,7 g; il rapporto tra la massa deve essere di 10:1. Questo è buono per una lastra PDMS spessa 3 mm su uno stampo con diametro 130 mm (5 pollici). Mescolare questi componenti accuratamente.
   2. Degas la miscela in un essiccatore per circa 45 min per rimuovere le bolle d'aria.
   3. Nel frattempo, preparare lo stampo per la miscela liquida di PDMS da attaccare nastro adesivo trasparente intorno allo stampo o posizionare lo stampo in un supporto adatto cialda.
   4. Versare il composto PDMS degassato su stampo. Se qualsiasi aria bolle è rimasto nella miscela PDMS o presso la superficie dello stampo, degas nuovamente per circa 30 min.
   5. Curare la miscela PDMS in forno a 60 ° C per 4 h. Consenti raffreddare.
   6. In una cappa a flusso incrociato, tirare il PDMS curata dallo stampo; lo stampo può essere riutilizzato immediatamente per rendere più repliche PDMS.
   7. Tagliare la replica PDMS in separato superiore e quella inferiore del chip utilizzando linee di taglio nel PDMS.
   8. Pugno quattro fori nella parte superiore, usando un punzone per biopsia tagliente con diametro di 1 mm a modulo ingressi e uscite. Punch da interno a esterno per evitare che i detriti PDMS dalla raccolta nel chip. Coprire le parti di chip con nastro adesivo trasparente per proteggerli dalla polvere.
   9. Membrane in policarbonato da inserti di Transwell tagliata a quadrati di circa 3 × 3 mm ².
2. Montare una membrana porosa trafilamenti tra due parti PDMS al fine di montare un dispositivo di due-strato interfacciata con una membrana porosa.
   Nota: Questo protocollo è adattato da Griep et al. ¹⁹ e Chueh et al. ²⁶
   1. preparare un mortaio PDMS/toluene utilizzando 0,7 g di agente base PDMS, 0,07 g di agente indurente e 540 µ l di toluene, risultante in un rapporto di peso di 5:3. Vortice il mortaio accuratamente.
   2. Spin-cappotto 200 µ l di mortaio sul vetrino coprioggetti a 1500 giri/min per 60 s (dilagato a 1000 giri/min/s) di acquisire un sottile strato uniforme di Malta.
   3. Trasferire un sottile strato di Malta dal coprioggetto sulla parte inferiore e una parte superiore del chip con un rullo inchiostrato. Mettere la parte inferiore in un piatto nel forno.
   4. Con un set di pinzette, immergere i bordi di una membrana nel mortaio spin-rivestito e posizionarlo attentamente nel mezzo la parte inferiore.
   5. Posizionare la parte superiore sulla parte inferiore, prestando attenzione all'allineamento.
      Nota: Non esercitare pressione sul chip e non far scorrere la parte superiore sulla parte inferiore per evitare che la Malta da inserire i canali e intasamento della membrana.
   6. Coprire le insenature di chip con nastro adesivo trasparente per evitare che la polvere penetri il chip e cuocere in forno a 60 ° C per 3 h.
3. Elettrodi integrare i canali collaterali.
   Nota: Questo protocollo è adattato da Griep et al. ¹⁹ e Douville et al. ¹⁸
   1. tagliare il filo di platino in pezzi di circa 2 cm. pulite immergendo loro in acetone per 30 min. risciacquo con acqua ed etanolo e lasciare per asciugare.
   2. In una cappa a flusso incrociato, mettere un chip su un piatto di plastica. Inserire i quattro fili di platino nei canali di elettrodo di un chip utilizzando un paio di pinzette e piegarle verso il basso sul piatto da portata in plastica per consentire la fissazione per il piatto in un passaggio successivo. Inserire i fili 0,7-1 mm nel canale cultura, superare il bivio per canale a forma di T.
   3. Applicare una goccia di colla UV-curable presso l'ingresso del canale di elettrodo e lasciare la colla riempire il canale intorno all'elettrodo di forze capillari.
   4. Accendere UV e cura la colla quando raggiunge la fine del canale elettrodo.
      Attenzione: Non guardare la sorgente di luce UV come questo può danneggiare gli occhi.
   5. Fissare i quattro elettrodi integrati per il piatto di plastica con un adesivo epossidico bicomponente. Questo consente di più facile gestione degli elettrodi durante le misurazioni senza il rischio di tirare gli elettrodi dal chip.
   6. Coprire i chip con nastro adesivo trasparente e cuocere in forno a 60 ° C per 2 h. Consenti far raffreddare e conservare la polvere fino all'utilizzo. In questo modo possono essere tranquillamente conservato per fino a un mese.

2. Cultura del cervello-ha derivato le cellule endoteliali su chip

1. cappotto i chip per promuovere il collegamento delle cellule.
   1. Riempimento entrambi canali con fosfato tampone salino (PBS) per bagnarle prima di introdurre i reagenti. Controllare al microscopio se ci sono eventuali bolle d'aria nei canali. In questo caso, rimuoverli sciacquando con PBS supplementare.
   2. Riempire entrambi i canali con 30 µ l di fibronectina umana di 20 µ g/mL in PBS. Incubare a 37 ° C per 3 ore. Verificare eventuali bolle d'aria e, se necessario, sciacquare i canali con PBS e riempire con soluzione di fibronectin.
   3. Lavare le patatine con il mezzo di crescita endoteliale e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ nell'incubatrice per 2 h.
   4. Misurare il TEER dei chip vuoto come descritto nel passaggio 3 per garantire che tutti gli elettrodi sono a diretto contatto con il fluido nei canali. Nei chip vuote, i valori tipici di TEER sono 0-1 Ω cm ².
2. Cellule di semi in canale superiore.
   1. Rimuovere il terreno di coltura da una boccetta di cultura (zona di coltura di 75 cm ²) con un monostrato confluente di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (hCMEC/D3).
   2. Lavare le cellule con PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% e incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 2-5 minuti fino a quando le cellule hanno staccato dalla beuta cultura.
   3. Disattivare la tripsina con cultura supplementato con 20% siero bovino fetale (FBS). Contare le celle e calcolare il numero totale di cellule in sospensione.
   4. Nel frattempo, centrifugare le cellule hCMEC/D3 a 390 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
   5. Risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato del mezzo di crescita endoteliale (EGM-2) per arrivare ad una concentrazione di 5 x 10 ⁶ cellule/mL. Questo si traduce in una densità di semina di 2 x 10 ⁵ cellule/cm ² nel chip.
   6. Lentamente Pipettare 30 µ l di sospensione cellulare ben miscelato in canale superiore e rimuovere la pipetta dall'ingresso in un movimento fluente pur ancora esercitando pressione.
   7. Verifica la densità di semina sotto un microscopio. Una distribuzione uniforme delle cellule durante il canale superiore dovrebbe essere raggiunto.
   8. Incubare i chip a 37 ° C e 5% di CO ₂ per almeno 1 h. scovare eventuali cellule non attaccate con terreno di coltura endoteliale.
3. Mantenere la cultura endoteliale su chip.
   1. Due volte al giorno, inserire le punte di pipetta piena di terreno di coltura come serbatoi nelle insenature e sostituire il mezzo all'interno del chip di gravità flusso.
      Nota: Per evitare bolle d'aria di entrare i microcanali e distruggendo lo strato delle cellule, assicurarsi di rendere fluido-fluido contatto tra la punta della pipetta e il fluido in cima il chip prima di inserire la punta in un'insenatura. Questo può essere facilitato con l'aggiunta di una piccola goccia presso l'in / presa prima dell'inserimento di pipetta.
   2. Anche aggiungere pipetta punta serbatoi nei punti vendita per evitare che i canali secchi.
   3. Incubare i chip a 37 ° C e 5% CO ₂.

3. Misurazioni di TEER su chip

1. impostare the apparecchi di misurazione TEER, composto di un lock-in amplifier e un circuito di cavo sonda come è stato specificato in Van der Helm et al. ¹⁶ in alternativa, potentiostats o impedenza analizzatori sono adatti anche per questi misure basate su impedenza TEER.
2. Prendere il chip dall'incubatrice e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente per almeno 10 min. Remove qualsiasi fluido dal piatto plastica attorno agli elettrodi per prevenire elettrodo gettare un ponte di fuori del chip.
3. Prendere lo spettro di impedenza da 200 Hz a 1 MHz per ogni combinazione di due elettrodi, con conseguente 6 spettri di impedenza per il circuito integrato in solo 5-10 min Check se gli spettri di impedenza avere il previste grandezze e forme per convalidare la misurazione TEER, come è descritto nella sezione risultati.
4. Mettere il chip indietro nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO ₂ dopo aver terminato la misurazione.
5. Elaborare gli spettri di impedenza ottenuti per arrivare ad un valore normalizzato di TEER.
   1. Get la misura resistenza tra elettrodi e , come indicato in Figura 2B e D, dall'altopiano resistivo a 10 kHz negli spettri di impedenza corrispondente.
   Tramite l'equazione di Figura 2 ¹⁶ punti
   2. Calculate TEER utilizzando le sei resistenze misurate corrisponde a un unico chip in una sola volta:
      
      in questa equazione, è l'area di cultura attraverso la quale è stata misurata la resistenza, < img alt = " L'equazione 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > è la resistenza della barriera cellulare e della membrana, , , e sono la resistenza valori misurati attraverso la barriera cellulare e e sono i valori di resistenza misurati nella canali rettilinei. ¹⁶ l'equazione è derivata dal circuito equivalente illustrato nella Figura 2.
6. Sottrarre il vuoto TEER da TEER tutti gli intervalli di tempo per ottenere lo sviluppo del TEER in tempo.

I risultati schematici di spettroscopia di impedenza elettrica attraverso un chip senza cellule (linea continua) e attraverso una barriera cellulare (linea tratteggiata) sono mostrati nella Figura 2A. Possono essere identificate quattro principali regioni, ciascuna dominata da un componente elettrico specifico. Sotto circa 1 kHz, la capacità di doppio strato all'interfaccia elettrodo-cultura media dominante, caratterizzata da una pendenza negativa per grandezza di impedenza e di sfasamento si avvicina-90 °. La frequenza in cui domina la capacitanza di doppio strato, dipende dalla zona dell'elettrodo esposta al mezzo di coltura. Il resistivo altopiano sopra 1 (senza cellule) o 100 kHz (con cellule) con uno spostamento di fase vicina a 0 °, corrisponde alla resistenza del terreno di coltura all'interno dei canali microfluidici, a seconda della lunghezza del canale e area della sezione trasversale e dentro il membrana, a seconda della porosità e spessore. Quando si misura attraverso una barriera cellulare, un altopiano extra resistivo tra 1 e 10 kHz è visto così come un massimo locale del diagramma di fase. Questa regione è di importanza critica per la determinazione della TEER come un chiaro aumento nei risultati di impedenza quando le cellule sono presenti nel percorso misurato e viene pertanto definite la "regione di interesse". Il pendio supplementare tra 10 e 100 kHz corrisponde la capacità della barriera delle cellule, che nasce dalle membrane bilayer del lipido elettricamente isolante e dipende l'area totale dello strato delle cellule. 27 i confini di queste regioni, come pure le magnitudini di impedenza dipendono dal sistema in fase di studio e modificare con, tra l'altro, dimensioni canale, conducibilità del terreno di coltura, posizionamento degli elettrodi e tipo delle cellule. Per ulteriori approfondimenti sulla teoria e la pratica di spettroscopia di impedenza elettrica su barriera-formando tessuti consiglia l'articolo di recensione di Benson et al . 28

Dati rappresentativi delle misurazioni TEER sono indicati per un chip vuoto sia un chip con uno strato di cellule endoteliali hCMEC/D3 cervello in Figura 2E e 2F, rispettivamente. In breve, la spettroscopia di impedenza è stata effettuata usando sei misurazioni con quattro elettrodi: due misurazioni attraverso canali riempiti di terreno di coltura delle cellule (linee continue) e quattro misurazioni attraverso i canali così come la membrana e - se presente - il barriera cellulare (linee tratteggiate). Questi percorsi di sei misura possono essere identificati nel circuito resistivo equivalente di Figura 2B, che è derivato dalla sezione trasversale schematica (Figura 2) e vista dall'alto (Figura 2D). Le misurazioni di chip vuoto (Figura 2E) mostrano la tipica forma degli spettri di impedenza senza cellule, come illustrato nella Figura 2A. Le misurazioni attraverso la barriera cellulare (linee tratteggiate in Figura 2F) ricordano gli spettri di impedenza tipica con le cellule nella Figura 2A. Nota che sia la grandezza di impedenza e la fase di spostamento aumento verso 1 MHz. Questa è la risposta tipica del setup di misura alle alte frequenze e non è di origine sperimentale.

Per determinare la TEER utilizzando questi spettri di impedenza sperimentale, in primo luogo la resistenza chip misurate è determinata, che è la resistenza totale di cella layer, canali e membrana. A tal fine, è stata scelta una frequenza di lettura adatto nella regione di interesse, che è al massimo locale nella fase trama con cellule, nei pressi di spostamento di fase di 0 ° senza cellule: 10 kHz. Con le sei resistenze misurate a 10 kHz, misurata tra i quattro elettrodi, il TEER è direttamente calcolata usando l'equazione Figura 2F.

Per indicare che il dispositivo presentato è adatto a determinare TEER in organi-on-chip, la BBB è stata replicata all'interno del chip e sua TEER è stato monitorato durante 3 giorni di cultura. In Figura 3A che media TEER ± errore standard della media (SEM) è indicato per quattro BBBs-on-chip, risultante in un altopiano di 22 ± 1,3 Ω cm2, che è paragonabile a TEER di questa linea cellulare come riportato in letteratura. 29 inoltre, dopo la cessazione dell'esperimento e fluorescenza la macchiatura dei nuclei, si vede che l'endotelio cerebrale formata un monostrato continuo all'interno del dispositivo (Figura 3B). Colorazione di immunofluorescenza della proteina di giunzione stretta Zonula Occludens-1 (ZO-1) ha mostrato che le cellule endoteliali cerebrali mantenuto loro fenotipo specifico BBB e formano complessi giunzionali stretti.

Figura 1: Progettazione e assemblaggio del dispositivo organo-on-chip con elettrodi integrati.
(A) vista esplosa del chip microfluidici, costituito da una parte superiore di PDMS con canale superiore (TC), una membrana (M) e un fondo parte PDMS con il canale inferiore (BC). Quattro elettrodi filo di platino (E1-4) inseriti e fissati nei canali laterali. Nel canale superiore e sulla parte superiore della membrana, le cellule endoteliali del cervello hCMEC/D3 sono state coltivate per replicare la BBB. (B) assemblati chip, fissato ad un piatto di plastica. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati di impedenza rappresentativo e determinazione di TEER.
(A) impedenza schematica dello spettro visualizzando impedenza grandezza (Ω) e sfasamento (°) vs frequenza (Hz), tipico per la spettroscopia di impedenza elettrica sui chip senza cellule (linea continua) e con le cellule (linea tratteggiata). Ci sono quattro principali regioni, ciascuna dominata da: la capacità di doppio strato presso gli elettrodi, la resistenza del terreno di coltura, la resistenza di barriera delle cellule e la capacità della membrana cellulare. La "regione di interesse" indica dove il contributo dello strato delle cellule possa essere quantificata (freccia rossa). (B) circuito resistivo equivalente del chip, mostrando il canale superiore resistenze R1 e R3, il fondo canale resistori R2 e R4 e la membrana e CE barriera resistore Rm. (C) sezione trasversale schematica mostrando le cellule endoteliali (CE) coltivate in canale superiore. (D) vista schematica superiore della BBB chip mostrando la configurazione degli elettrodi e la zona di coltura di 0,25 mm2 attraverso il quale l'impedenza è misurata. (E) spettri di impedenza rappresentativo di un chip vuoto riempito con terreno di coltura cellulare. (F) tra gli spettri di impedenza rappresentativo di un chip in cui hCMEC/D3 cervello cellule endoteliali erano coltura per 3 giorni. (G) Formula per calcolare TEER dalle resistenze misurate tra tutte le sei combinazioni di quattro elettrodi. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 per favore clicca qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.

Figura 3: Sviluppo di TEER rappresentativo di BBB-on-chip.
(A) TEER media ± errore standard della media (SEM) dei quattro BBBs-on-chip durante un periodo di cultura di tre giorni, raggiungendo un plateau a 22 ± 1,3 Ω cm2 (media ± SEM). Per confronto, dati di chip vuoto sono inclusi, mostrando variazione marginale e deviazione da 0 Ω cm2 nello stesso periodo rispetto alla variazione e il valore delle chip TEER alle cellule. (B) microscopia di fluorescenza dei nuclei macchiati ha rivelato un continuo monostrato di endotelio, sia il PDMS e la membrana nella posizione indicata nella rientranza. (C) l'immunofluorescenza ha rivelato la presenza di proteina di giunzione stretta Zonula Occludens-1, che indica che il giunzioni strette BBB-specifiche tra le cellule danno luogo al TEER misurato. Ristampato e adattato con permesso da Elsevier. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.