Questo articolo viene descritta una suite di tecniche in luce e la microscopia elettronica per studiare l'anatomia interna ed esterna dell'occhio degli insetti. Questi includono diverse tecniche tradizionali ottimizzate per il lavoro su occhi di formica, dettagliati risoluzione dei problemi e suggerimenti per l'ottimizzazione per diversi esemplari e aree di interesse.
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Articolo metodologico
Tecniche per lo studio dell'anatomia del sistema visivo Ant
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo viene descritta una suite di tecniche in microscopia (LM) e microscopia elettronica (EM) che può essere utilizzata per studiare l'anatomia interna ed esterna dell'occhio degli insetti. Questi includono tecniche istologiche tradizionali ottimizzato per il lavoro sugli occhi di formica e adattato a lavorare di concerto con altre tecniche quali la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia elettronica a scansione (SEM). Queste tecniche, sebbene notevolmente utile, possono essere difficile per il microscopista novizio, quindi grande enfasi è stata posta in questo articolo sulla risoluzione dei problemi e ottimizzazione per diversi esemplari. Forniamo informazioni su tecniche di imaging per l'intero campione (foto-microscopia e SEM) e discutere i vantaggi e svantaggi. Evidenziamo la tecnica utilizzata nel determinare i diametri della lente per l'occhio intero e discutere nuove tecniche per il miglioramento. Infine, verranno illustrate tecniche coinvolte nella preparazione dei campioni per LM e TEM, sezionamento, colorazione e questi campioni di imaging. Discutiamo le transenne che uno potrebbe venire da altra parte quando preparare campioni e il modo migliore per navigare intorno a loro.
Introduzione
Vision è una modalità sensoriale importante per la maggior parte degli animali. Visione è fondamentale soprattutto nel contesto della navigazione per individuare obiettivi, che istituisce e aderendo alle rotte e come ottenere informazioni bussola1,2. Insetti di rilevare informazioni visive usando un paio di occhi composti e, in alcuni casi, da uno a tre posti dorsalmente semplici occhi chiamato ocelli3,4,5.
Gli occhi di formiche sono di particolare interesse perché, mentre le formiche sono meravigliosamente diversificate, conservano alcune caratteristiche chiave tra le specie. Nonostante la drammatica variazione in anatomia, dimensioni e l'ecologia, la maggior parte delle specie è eusociali e vive in colonie; di conseguenza, diverse specie affrontano sfide simili visual in termini di navigazione avanti e indietro tra un posto centrale e risorse. Attraverso le formiche la stessa base occhio bauplan può essere osservata in animali che vanno da 0,5-26 mm in lunghezza del corpo, da esclusivamente diurno di specie strettamente notturne e da lento a piedi sotterraneo leaping visual predatori6,7, 8,9,10. Tutte queste differenze sconcertante in ecologia e comportamento dar luogo a innumerevoli permutazioni delle stesse strutture di base dell'occhio per adattarsi a diversi ambienti, stili di vita e dimensioni del corpo11,12. Di conseguenza, studiando l'ecologia visiva di formiche fornisce un vero e proprio tesoro di possibilità per l'investigatore risoluto.
Capire il sistema visivo degli insetti è essenziale a comprendere un loro funzionalità comportamentale. Questo è evidente da studi integrativa che ben combinano anatomia con ecologia e il comportamento di un grande successo in alcuni gruppi di insetti (per esempio, riferimenti13,14,15,16, 17). anche se il campo di navigazione di formica e il comportamento della formica, in generale, è stato molto efficace, pochissima enfasi è stata posta sulla visione di formica di fuori di alcune specie selezionate. Qui, ci soffermeremo sulle tecniche coinvolte nell'inchiesta di disegno dell'occhio di formiche. Mentre ci si concentrerà sulle formiche, queste tecniche possono essere applicate, con lievi modifiche, agli altri insetti, troppo.
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Protocollo
1. preparazione
Nota: È necessario prima capire la posizione relativa dell'occhio composto e ocelli a vicenda e sulla testa. Ciò può essere ottenuto con l'acquisizione di immagini di vista dorsale della testa. Per questo, si consiglia di campioni di elaborazione per la fotomicrografia o utilizzando tecniche di SEM. Di seguito sono passaggi coinvolti in entrambi i processi.
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Raccolta dei campioni
- Raccogliere e conservare i campioni direttamente in etanolo al 70%. Raccogliere diverse caste quando possibile.
- Etichettare i campioni con ora, data e così come eventuali altre osservazioni pertinenti (ad es., raccolti durante il foraggiamento, accoppiamento aggregazione, nido all'interno di un ramoscello, ecc.)
- Raccogliere abbastanza esemplari per avere più replicati in ogni trattamento.
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Microfotografia e Z-stacking
- Aria secchi esemplari e montarli sul punto triangolare carte, utilizzando colla solubile in acqua e poi su un pin di insetto. Per informazioni dettagliate, vedere riferimento18.
- Immagine utilizzando un microscopio stereoscopico ad alto ingrandimento con un Z-stepper motor e una telecamera a colori.
- Utilizzare un diffusore per avere un'illuminazione uniforme per gli esemplari.
- Catturare immagini a diversi piani focali e salvare le immagini in un formato di file senza perdita di dati (ad esempio tiff) e stack di messa a fuoco usando il software disponibile in commercio.
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I micrografi elettronici di scansione
Nota: Pulire accuratamente tutti gli strumenti e le superfici di lavoro con etanolo per evitare la contaminazione del campione con la polvere e altre particelle.- Disidratare esemplari in etanolo durante la notte e aria secca in una capsula di Petri.
- Utilizzare una lama di rasoio affilata per separare la testa dal resto del corpo.
- Montare la testa con l'angolo di visualizzazione richiesti (ad es., dorsale rivolto verso l'alto) su alluminio Stub utilizzando nastri di carbonio conduttivo o schede. Tagliare il nastro di carbonio in strisce sottili e piegarlo per supportare la capsula testa.
- Utilizzare una macchina a polverizzazione per applicare oro sulla superficie dell'esemplare per 2 min a 20 mA con un palco rotante. Il tempo e la corrente potrebbe essere necessario essere regolata a seconda dello strumento.
- Trasferire gli esemplari a un nuovo stub di alluminio con nastri di carbonio fresco o tabulazioni.
Nota: Il carbonio non patinato fornirà uno sfondo nero, ma trasferire esemplari possono danneggiare il rivestimento in oro. - Controllare che l'orientamento del campione sia ancora corretto utilizzando un microscopio da dissezione e regolare se necessario con un paio di una pinzetta o un attrezzo simile. Fare attenzione a non per graffiare il rivestimento d'oro; manico è il meno possibile.
- Caricare i campioni sul supporto albero mozzo del SEM, prendendo nota della posizione di stub ed esemplari uno rispetto a altro.
Nota: Alcuni SEMs sono dotati di una fotocamera di fase ma molti non lo sono e può essere difficile da individuare piccoli esemplari ad alto ingrandimento. - Gli esemplari della battuta. Per evitare di ricarica ed una piccola apertura per buona profondità di campo, utilizzare una bassa tensione di accelerazione.
Nota: Le impostazioni sono ottimizzate in consultazione con un tecnico specializzato in particolare strumento in uso.
2. quantificazione Facet numeri e diametri
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Repliche di cornea
- Utilizzare le formiche conservati in etanolo o montato su un perno per questo scopo (punto 1.1.1).
- Montare l'animale su un pin di insetto o su plastilina. Se la testa è relativamente grande, le restanti parti del corpo possono essere rimosso.
- Utilizzare un pin di insetto o uno stuzzicadenti bene a prendere una piccola goccia di smalto per unghie incolore ad asciugatura rapida e si diffuse rapidamente sopra l'occhio. Assicurarsi che il perno non si graffia l'occhio. Lo smalto dovrebbe coprire tutto l'occhio e alcuni della capsula testa circostante.
Nota: È importante che lo smalto sia di spessore relativamente uniforme attraverso l'occhio. - Lasciare lo smalto di chiodo per impostare a temperatura ambiente.
- Una volta che è completamente impostato, utilizzare un pin insetto bene per sollevare delicatamente la replica dalla testa capsula che circonda l'occhio.
- Utilizzare un bel paio di pinzette pulite per sollevare la replica, afferrare la parte della replica che copre la testa e non l'occhio.
- Garantire la consapevolezza dell'orientamento dell'occhio: la regione anteriore, posteriore, dorsale e ventrale.
- Inserire la replica su un vetrino. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare la replica rimuovendo accuratamente il materiale in eccesso intorno all'occhio. Utilizzare un ago o un paio di pinze per impedire la replica di spostare.
- Se l'occhio è molto convesso, è possibile utilizzare una lama di rasoio per fare 3-4 belle incisioni radiali parziale intorno al bordo per aiutare 'appiattire' la replica. Se l'occhio è relativamente 'piatto', non esiste alcuna necessità di rendere tali incisioni.
- Appoggiare delicatamente un coprioggetto sulla replica di occhio, assicurando che l'orientamento della replica è noto. Non esercitare una pressione come questo può eliminare l'impressione cornea sullo smalto.
- Sigillare il coprioggetto utilizzando pochissimo smalto sui quattro angoli. Se lo smalto scorre tra i vetrini coprioggetto e vetrini, danneggia la replica.
- Immagine della diapositiva su un microscopio composto.
Nota: se solo alcuni aspetti sono a fuoco, quindi questo suggerisce che la replica di occhio non abbastanza semplificata. Ignorare e iniziare nuovamente dal punto 2.1.3. - Nei programmi liberamente disponibili come ImageJ/Fiji dove può essere misurati il numero di ommatidi e dimensione di ogni ommatidi, importare l'immagine.
Nota: Questo metodo può essere utilizzato per preparare le repliche di ocelli, troppo. Trattandosi di una sola lente, si consiglia di mantenere tutti gli ocelli insieme in una replica.
3. analizzare la struttura dell'occhio
Nota: Per studiare l'anatomia dell'occhio richiede nella maggior parte dei due tecniche complementari di casi di LM e TEM. Le fasi di lavorazione iniziale richiedono tecniche simili per TEM e LM. La differenza deriva dalla fase di sezionamento in poi. Trattamento dei campioni richiede l'utilizzo di sostanze chimiche pericolose che devono essere maneggiati con cura e scartati in modo responsabile. Utilizzare dispositivi di protezione individuale, lavorare in una cappa, sempre leggere il sheets(SDS) di dati di sicurezza e svolgere valutazioni del rischio prima di iniziare.
- Dissezione
- Anestetizzare gli esemplari da raffreddamento o da esposizione a gas CO2.
- CO2 anestesia è molto veloce (generalmente meno di 1 min) e la cura dovrebbe essere presa per evitare sovraesposizioni come questo può provocare la morte dell'esemplare. Se si utilizza pellets di ghiaccio secco (solido CO2) evitare il contatto diretto con esemplari come questo può causare bruciature da freddo.
- L'anestesia freddo è più lento; 4 ° C è sufficiente, e le temperature più fredde non sono raccomandate. Stabilire un tempo di raffreddamento adeguato per la specie. Fredde o grandi formiche resistenti quali le formiche Toro possono richiedere > 10 min per diventare completamente immobilizzato, mentre specie più piccole possono solo bisogno di 1-2 min eccessivo raffreddamento ucciderà l'esemplare (evitare il contatto diretto con ghiaccio). Esemplari preferibilmente dovrebbero essere tenuti in contenitori piccoli, tappo di gomma piuma, plastica e inseriti in una ghiacciaia dove possono essere osservati, invece che in un frigorifero elettrico o in freezer.
- Collocare il campione su una piastra di Petri e regolare per la visualizzazione al microscopio per dissezione. Lavorando in fretta è importante per preservare l'anestesia e per evitare la degenerazione del tessuto una volta le incisioni sono fatte (questo può) accadere in pochi secondi.
- Rimuovere antenne con le pinzette. Se si lavora con un insetto pungente, si consiglia di amputare il gaster prima per evitare di essere fregati.
- Rimuovere le parti della bocca utilizzando una lama di rasoio affilata; forcipe può essere usato per il campione tenendo premuto. Tagliare la parte anteriore dell'occhio (grandi esemplari) o più vicino possibile agli occhi come possibile (piccoli esemplari) senza strattoni sul cervello come questo possono strappare la retina.
- Preparatevi ad aprire la capsula a testa. Angolo del campione in modo che la prima incisione è rivolta verso l'alto; Questo può essere fatto sia sotto il microscopio per dissezione tenendo l'esemplare in forcipe o sotto controllo visivo mentre si tiene l'esemplare tra il dito pollice e ribalta.
- Fare un'incisione trasversale attraverso la testa di rimuovere la parte ventrale della testa; parte dell'occhio ventrale può essere rimossi in specie di grandi dimensioni per migliorare la fissazione e l'infiltrazione. La testa deve essere ancora attaccata al corpo a questo punto.
- Recidere la capsula testa dal corpo facendo un'incisione della corona appena dietro l'occhio composto.
- Inserire la capsula testa dissecata con gli occhi compound in fissativo freddo ghiaccio: 2,5% paraformaldeide glutaraldeide e 2% in tampone fosfato (pH 7.2-7.5).
Attenzione: Fissativo è corrosivo e tossico; indossare una protezione appropriata e lavorare in una cappa aspirante.
Nota: È importante lavorare rapidamente per arrestare la degenerazione del tessuto neurale. La dissezione dovrebbe essere completato in 2 min o meno (dissezione efficiente può richiedere un po' di pratica).
Nota: Se l'occhio deve essere adattato alle condizioni luminose o scure, prima esporre gli animali alla condizione di luce necessaria per poche ore. Svolgere le dissezioni nelle rispettive condizioni di luce. Dissezioni possono essere effettuate sotto luci rosse per simulare le tenebre.
- Anestetizzare gli esemplari da raffreddamento o da esposizione a gas CO2.
- Trattamento dei campioni
- Tenere gli esemplari il fissativo a temperatura ambiente con movimento su agitatore orbitale, per campioni di grandi dimensioni di 2 h. potrebbero richiedere tempi più lunghi di fissazione.
- Rimuovere il fissativo e smaltire in modo appropriato. Lavare i campioni a temperatura ambiente di tampone fosfato (3 volte, 5 minuti ciascuno) sull'agitatore.
Nota: Il tampone fosfato è composto da 8 g NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g Na2HPO4e g 0,244 KH2PO4 in 1 L di acqua distillata H2O (pH 7,2). - Rimuovere il tampone di fosfato e aggiungere 2% OsO4. Mettete il contenitore del campione sull'agitatore nella cappa fumi per 1-2 h. Si tratta di un passaggio di post-fissazione per Difficoltà grassi nonché un contrasto TEM.
Nota: I tempi di fissazione osmio sono soggette a dimensione del campione; come una regola approssimativa, calcolare 1 h di fissaggio per 1 mm3. - Rimuovere la soluzione di osmio e smaltirla in modo appropriato. Lavare gli esemplari in tampone a temperatura ambiente (3 volte, 5 minuti ciascuno) sull'agitatore.
- Disidratare gli esemplari ponendoli in aumento delle concentrazioni di etanolo o acetone; ad esempio, 50, 70, 80 e 95% per 10 minuti ciascuno e infine 100% (2 volte, 15 minuti ciascuno). Posizionare gli esemplari nell'agitatore tra i cambiamenti di soluzione.
Nota: Se necessario, campioni possono essere conservati in etanolo al 70% durante la notte. - Scolare l'etanolo e aggiungere 100% di acetone. Lasciare per 20 minuti sull'agitatore (salta questa tappa se esso disidratazione in acetone). Sostituire con acetone fresco e lasciarlo per altri 20 minuti.
- Infiltrano i tessuti con resina utilizzando i seguenti rapporti di acetone alla resina: 2:1 (3 h), 1:1 (pernottamento), 1:2 (4h) e resina pura (una notte). Ad ogni passo lasciare esemplari nell'agitatore all'interno della cappa fumi e tappo del contenitore per tutti, ma gli ultimi due passaggi.
Nota: La resina è troppo viscosa per essere svuotato così gli esemplari devono essere spostati in un nuovo contenitore usa e getta ad ogni passo. - Preparare blocchi di montare i campioni. Blocchi possono essere personalizzati realizzati da taglio vetro acrilico in piccoli blocchi rettangolari (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Blocchi possono anche essere fatta di resina epossidica colata (ci sono molti corredi commerciali disponibili) in uno stampo di silicone e quindi curarla in forno per 12-14 ore a 60 ° C.
Attenzione: La resina non polimerizzata (liquida) è cancerogena e deve essere restituita al forno fino a quando non completamente indurito. - Posizionare il blocco verticalmente nello stampo. Attentamente prendere gli esemplari dalla resina liquida, consentire l'eccesso di resina drenare e posizionare il campione sulla parte superiore del blocco. Una piccola quantità di resina aggiuntiva può essere utilizzata per associare l'esemplare al blocco.
- Etichettare il blocco. Stampare le etichette di carta e incorporarlo nel blocco o allegarlo a una faccia del blocco.
- Tenere lo stampo con i blocchi incorporati in forno per 12-14 ore a 60 ° C.
- Memorizzare il blocco di campione in una busta pulita. Questo può essere riposto in questo modo nel corso di diversi mesi o anni.
- Lasciare i contenitori usati, guanti sporchi e altre attrezzature contaminate nella cappa per consentire acetone a evaporare completamente (minimo 12 ore).
- Curare la resina nel forno prima di smaltire il materiale monouso o raschiatura resina fuori altri oggetti quali pinze.
- Sezionamento
- Osservare il blocco sotto il microscopio per dissezione per garantire che l'orientamento del campione sia appropriata per il piano di sezione.
- Se l'orientamento non è appropriato, è possibile utilizzare ha visto un gioielliere per tagliare fuori il campione e ri-orientare utilizzando frammenti di set resina e resina fresca per reinserire l'esemplare. La testa può essere anche suddiviso in due metà per sezionare i due occhi separatamente. Curare la resina ancora prima di procedere.
- Montare il blocco sul mandrino estraibile microtomo. Rimuovere il mandrino e il titolare.
- Tagliare il blocco di resina utilizzando una lama di rasoio sotto il microscopio per dissezione.
Attenzione: Non farlo quando il mandrino è montato sul braccio microtomo come può scuotere il braccio e danneggiare i cuscinetti. - Rimontare il mandrino sul braccio di un microtomo e angolo del campione.
- Montare il coltello al titolare l'angolo appropriato (0° per la lama di vetro, vedere le istruzioni del produttore per coltelli di diamante).
Nota: Coltelli di vetro possono essere fatto a buon mercato con un coltellinaio di vetro ma devono essere sostituiti periodicamente come perdono il loro bordo; coltelli di diamante di alta qualità possono essere acquistati, ma sono costosi, richiedono cure particolari e non sono adatti per i principianti. - Riempire la barca di coltello con acqua distillata usando una siringa dotata di un filtro (dimensione dei pori di 0.45 µm).
- Riempire la barca fino a quando il livello dell'acqua raggiunge il bordo del coltello; il menisco può essere convesso in altre zone della barca.
- Drenare la barca fino a quando il menisco è molto leggermente concavo, ma ancora raggiunge il bordo del coltello. Il livello dell'acqua può essere regolato in qualsiasi punto, ma sempre lontano dal bordo del coltello.
- Con attenzione portare il coltello verso il campione e allineare il blocco al coltello. Questo è meglio farlo lentamente, periodicamente controllando la vicinanza del coltello attraverso l'oculare e dal lato.
Nota: Controllare il manuale dello strumento per istruzioni specifiche come strumenti variano. - Impostare lo spessore di sezione del microtomo. Selezionare lo spessore corretto sarà dipendente dalla dimensione del campione, regione di interesse e il tipo di coltello utilizzato.
- Se usando un coltello di vetro seleziona un'impostazione superiore (ad esempio, 4 µm), se un sacco di materiale deve essere tagliati via prima di raggiungere l'area di interesse. Se viene utilizzato un coltello di diamante o se il campione è molto piccolo, 1-2 µm può essere più appropriato.
- Avviare il "taglio" (avviamento della ruota microtomo) quando il coltello è vicino ma non ancora tagliando il campione per eseguire l'ultima parte dell'approccio. Sezioni dovrebbero iniziano ad apparire all'interno di alcune rotazioni; in caso contrario, interrompere e molto attentamente portare il coltello un po' più vicino.
- Regolare la sezione raccolta spessore (1 µm per sezioni semi-sottile) quando si avvicina la regione di interesse.
- Raccogliere tutte le sezioni utilizzando uno strumento di ciglia.
Nota: Strumenti di ciglia possono essere fatta con un ciglio montato su un bastone sottile con lo smalto. - Se un sacco di materiale dovrà essere rimossi, consentire le sezioni di accumulare e rimuovere in massa rimuovendo il coltello e vampate di calore fuori con acqua. Se usando un coltello di vetro, questo potrebbe essere un momento opportuno per modificare una sezione fresca del coltello o un coltello nuovo.
- Posto una serie di piccole goccioline di acqua distillata in una diapositiva utilizzando una pipetta Pasteur o idealmente, il filtro dotato di siringa.
- Galleggiante con attenzione la sezione raccolta sul ciglio sulla gocciolina di acqua.
- Raccogliere le sezioni come questo fino a quando non è opportuno verificare la profondità di taglio.
Nota: Anche se può essere noioso, è sempre meglio controllare spesso. - Porre il vetrino su una piastra riscaldante impostata a 60 ° C. Consentire tutte le acqua di evaporare e la sezione di aderire alla diapositiva.
- Colorante blu per 10-60 s sezioni con toluidina (tempo di colorazione variano con lo spessore della sezione). Dispensare il colorante con una siringa dotata di un filtro (come sopra).
- Mettere una goccia di tintura su un'estremità del vetrino e diffonderla utilizzando il lato dell'ago senza toccare o raschiare le sezioni. Porre il vetrino sulla piastra per circa 10-20 secondi.
- Sciacquare il vetrino spruzzando con acqua distillata in una bottiglia di lavaggio e posizionarlo sulla piastra calda per asciugarlo.
- Controllare sotto il microscopio composto e la loro immagine.
- Ripetere finché non si raggiunge la regione di interesse.
- Per le sezioni ultrasottili: impostare lo spessore di taglio tra 40-60 nm per raccogliere le sezioni TEM.
- Taglio su 3-5 sezioni e controllo spessore utilizzando una tabella di colore di interferenza. Sezioni dovrebbero riflettere grigio chiaro quando hanno visto ad un angolo.
Nota: Fumi di cloroformio possono essere dispensati sopra sezioni per rilassarsi eventuali pieghe. Questo è più rilevante per gli utenti esperti e principianti non devono preoccuparsi. Troppo cloroformio rilasciato troppo vicino alla sezione possa danneggiare le sezioni. - Raccogliere una griglia di slot Formvar-rivestito, il rame, tenuta con una pinza con il lato di Formvar. Fare attenzione a non forare il rivestimento Formvar.
- Immergere la griglia in barca edgeways e lontano le sezioni, quindi portare la griglia a parallelo alla superficie sotto le sezioni. Se necessario è possibile utilizzare le ciglia per guidare le sezioni sopra la griglia.
- Tamponare con attenzione intorno alla punta della pinza con carta da filtro per assorbire acqua intrappolata tra le braccia. Se ciò non avviene, la tensione idrica può sollevare la griglia tra le braccia o farlo aderire ad un lato. Questo può causare contaminazione o danni meccanici.
- Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla griglia stessa levandosi in piedi la griglia sempre su carta da filtro.
- Posizionare la griglia in un supporto di griglia.
- Ripetere fino a quando sono stati raccolti abbastanza sezioni.
- Sezioni semi-sottile possono essere imaged direttamente con qualsiasi microscopio composto dotato di una fotocamera. Olio di immersione può essere posizionato direttamente sulle sezioni. I vetrini devono essere conservati in una scatola di diapositiva per evitare lo scolorimento.
- Ultra-sottile sezione per contrasto TEM di colorazione
Nota: La seguente procedura deve avvenire sotto copertura come le tinture sono luce e CO2 sensibili. Inoltre, EM coloranti utilizzano metalli pesanti per la produzione di contrasto e sono quindi sostanze pericolose. Cure appropriate devono essere prese maneggiare queste macchie.- Coprire alcuni grandi piatti Petri con foglio di alluminio per bloccare la luce. Lavorare sotto questi per le fasi successive. Parzialmente scoprirle per consentire lo spazio di lavoro ma posto le copertine indietro il più presto possibile.
- Tagliare un pezzo di pellicola di cera e posizionare accuratamente cinque gocce di acetato di uranile 6% saturata su di esso utilizzando una pipetta Pasteur.
- Per preparare la soluzione, mescolare 2 g di acetato di uranile con 100 mL di metanolo al 50% in acqua distillata e filtrare la soluzione prima dell'uso. La soluzione non può essere memorizzata e dovrebbe essere fatta fresca ogni tempo19.
- Attentamente pick up le griglie TEM con forcipe ed equilibrio sulla cima di gocce di tintura con il lato di sezione verso il basso. Lasciare agire per 25 min.
- Sciacquare le griglie singolarmente immergendoli rapidamente dentro e fuori di acqua distillata; progresso attraverso quattro diverse fiale di acqua distillata.
- Posizionare cinque gocce di citrato di piombo su un pezzo di pellicola fresca. Organizzare qualche pellet di NaOH intorno le gocce di tintura (questo assorbe atmosferica di CO2 per impedire la precipitazione di carbonato di piombo).
- Per rendere la soluzione di citrato di piombo, preparare l'acqua bi-distillata da acqua distillata bollente per 0,5 h. Consenti l'acqua per raffreddare ed in un recipiente ermetico, aggiungere citrato di piombo di 0,3 g per 100 mL di acqua bi-distillata. Aggiungere 1 mL 10 M NaOH, sigilla ermeticamente il contenitore e agitare fino a disciolto19.
- Posizionare le griglie sulle gocce tintura come descritto ai punti 4.3 e copertura. Macchia per 5 min.
- Sciacquare in acqua distillata come prima immergendo le griglie dentro e fuori acqua distillata 20 volte. Progresso attraverso tre vasi di acqua distillata.
- Assorbire l'acqua in eccesso con carta da filtro e consentire le griglie ad asciugare in una casella della griglia.
- Immagine in un TEM a bassa tensione di accelerazione.
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Risultati
I metodi descritti qui abilitare studio dettagliato dei semplici e occhi composti di formiche. Vista dorsale della testa usando Z-stack fotomicrografia tecniche di imaging permette di ottenere una panoramica del layout del sistema visivo (Figura 1). Si tratta di una buona preparazione per dissezioni e per determinare l'angolo di taglio desiderato. Questa tecnica è anche utile per effettuare le misurazioni come larghezza della testa, occhio lunghezza e diametr...
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Discussione
La suite dei metodi descritti sopra consentono un'efficace indagine il sistema ottico di formiche e altri insetti. Queste tecniche di informare la nostra comprensione della risoluzione di campionamento, sensibilità ottica e potenziale sensibilità di polarizzazione dell'occhio in fase di studio. Questa conoscenza fornisce una base importante per indagini fisiologiche e comportamentali nella loro capacità visiva. Inoltre, mentre i metodi descritti qui sono concentrati su sistemi visivi formica, queste tecniche possono esse...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati a Jochen Zeil, Paul Cooper e Birgit Greiner per condividere le loro conoscenze in anatomia degli insetti e per dimostrare alcune delle tecniche che abbiamo descritto qui. Siamo grati per il personale di talento e di supporto al centro per microscopia avanzata alle ANU e la microscopia Unit presso MQU. Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio laureato a FRE e sovvenzioni da Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Formica | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscopio | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Etanolo | Sigma Aldrich | ||
| Piastra di Petri | ProSciTech | ||
| Microscopio da dissezione | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Smalto per unghie incolore | Non di marca: in qualsiasi negozio | ||
| cosmetici Vetrino | ProSciTech | ||
| Lama di rasoio | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Vetrino coprioggetti | ProSciTech | ||
| Microscopio composto | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldeide | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Cloruro di Potassio (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Idrogeno fosfato (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassio di-idrogeno fosfato (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Cloruro (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmio tetrossido | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Resina epossidica | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipetta | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
Riferimenti
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