Method Article

Quantificare i microrganismi alle concentrazioni basse usando microscopia digitale oleografica (DHM)

DOI:

10.3791/56343

⸱

November 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

In This Article

Summary

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Microscopia digitale oleografica (DHM) è una tecnica volumetrica che permette immagini campioni che 50-100 X più spessa di microscopia in campo chiaro a risoluzione paragonabile, con messa a fuoco eseguita post-elaborazione. Qui DHM viene utilizzato per l'identificazione, conteggio e microrganismi di rilevamento molto bassa densità e confrontato con misurazioni di densità ottica, germi e diretto.

Abstract

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Con precisione rilevando e contando sparsi campioni batterici ha molte applicazioni nel cibo, bevanda e le industrie di trasformazione farmaceutica, nella diagnostica medica e per il rilevamento di vita tramite missioni robotiche di altri pianeti e lune del sistema solare. Attualmente, radi campioni batterici sono contati da microscopia di placcatura o epifluorescenza di cultura. Piastre di coltura richiedono lunghi tempi di incubazione (giorni o settimane), ed epifluorescenza richiede vasta macchiatura e concentrazione del campione. Qui, noi dimostrare come utilizzare fuori asse microscopia digitale oleografica (DHM) per enumerare i batteri nelle colture molto diluite (100-104 cellule/mL). In primo luogo, la costruzione del DHM personalizzato è discussa, insieme a istruzioni dettagliate sulla creazione di uno strumento di basso costo. I principi dell'olografia sono discussi, e viene utilizzato un modello statistico per stimare quanto tempo video dovrebbe essere quello di individuare le cellule, basate sulle caratteristiche prestazioni ottiche dello strumento e la concentrazione della soluzione batterica (tabella 2) . Video di rilevamento delle cellule alle 105, 104, 103e 100 cellule/mL è dimostrato in tempo reale utilizzando gli ologrammi non ricostruiti. Ricostruzione di immagini di ampiezza e fase è dimostrata utilizzando un pacchetto di software open-source.

Introduction

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Determinazione delle conte batteriche accurate in campioni molto diluite è cruciale in molte applicazioni: alcuni esempi sono acqua e cibo qualità analisi1,2,3; rilevamento di agenti patogeni nel sangue, liquido cerebrospinale o espettorato4,5; produzione di prodotti farmaceutici, tra cui acqua sterile6; e l'analisi di comunità ambientale in ambienti oligotrofici come le aperto oceano e sedimenti7,8,9.....

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Protocol

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1. crescita e l'enumerazione dei batteri

Nota: questo è applicabile a quasi qualsiasi ceppo batterico cresciuto nel medio appropriato 36. Nel nostro esempio, usiamo tre ceppi: i marcescens del Serratia come un ceppo comune, facile laboratorio identificabili; e un più piccolo ceppo ambientale altamente motile, Shewanella oneidensis MR-1. Per confrontare il rilevamento di motili vs cellule non motili, non motili Shewanella mutante, Δ FlgM, è anche utilizzato per confronto 37. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo (LB) di Lisogenesi.

  1. Preparare mezzo LB ste....

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Results

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I risultati dovrebbero indicare la capacità di rilevare batteri vivi e morti a livelli molto bassi di DHM. Il numero di batteri contati deve essere coerenza con i risultati ottenuti con i conteggi di camera e piastra conteggio Petroff-Hauser. Metodi statistici standard forniscono informazioni circa la precisione dei metodi di rilevazione diverse a varie concentrazioni batteriche.

La figura 1 Mostra .......

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Discussion

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Ricostruzione digitale di ologrammi: per la ricostruzione numerica degli ologrammi, viene utilizzato il metodo di spettro angolare (ASM). Ciò comporta la convoluzione dell'ologramma con funzione di Green per DHM. Il fronte d'onda complesso dell'immagine a un particolare piano focale può essere calcolato utilizzando il teorema di convoluzione di Fourier come segue:

figure-discussion-1(1)

Dove

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori riconoscono la Gordon e Betty Moore Foundation sovvenzioni 4037 e 4038 al California Institute of Technology per il finanziamento di questo lavoro.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto YeastBD Biosciences212750
Bacto TryptoneBD Biosciences211705
Cloruro di sodioSigma-Aldrich7710Molte opzioni per l'acquisto
Bacto AgarBD Biosciences214010
Piastre di Petri da 10 cmVWR10053-704
Provette per coltura da 15 mLFalcon ( Corning Life Sciences)352002
Camera Petroff-HauserSiringhe di microscopia elettronica Sciences3920
10 mL BDBiosciences309604Punta Luer-Lok non necessaria
Luer maschio a raccordo spinato da 1/16"McMaster-Carr51525K291
Autoclavabile 1/16" ID Tubo in PVC per flussoNalgene8000-0004Venduto per lunghezza, acquistare di conseguenza
Pompa a siringaHarvard ApparatusPHD 2000
Camera di campionamentopersonalizzatan/aVedere la sezione Materiali
Microscopio olograficopersonalizzaton/aVedere Wallace et al.
Software open sourcehttps://github.com/bmorris3/shampoopersonalizzato
a tappo sciolto da

References

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  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

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