Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l'introduzione in coltura in vitro .
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Articolo metodologico
Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umani sangue trematodi, Schistosoma spp., hanno un ciclo di vita complesso che coinvolge fasi dello sviluppo sessuale e asessuale all'interno di un lumaca intermedi e di mammifero ospite finale, rispettivamente. La capacità di isolare e sostenere le fasi del ciclo di vita diverso in condizioni di coltura in vitro ha notevolmente facilitato le indagini dei meccanismi cellulari, biochimici e molecolari che regolano l'host, la sviluppo e la crescita del parassita interazioni farmacologiche. Trasmissione della schistosomiasi richiede la riproduzione asessuata e lo sviluppo di più stadi larvali all'interno dell'host lumaca; dal miracidium infettiva, attraverso sporocisti primarie e secondarie, alla fase finale cercarial che è infettivo agli esseri umani. In questa carta presentiamo un protocollo passo-passo per massa schiusa e isolamento di Schistosoma mansoni miracidia da uova ottenute dai fegati di topi infetti e la loro successiva introduzione in coltura in vitro . Si prevede che il protocollo dettagliato incoraggerà nuovi ricercatori per partecipare e ampliare questo importante settore della ricerca di schistosome.
Introduzione
L'essere umano sangue flukes Schistosoma spp., sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia tropicale trascurata che affligge un stimato 230 milioni di persone in tutto il mondo1. La specie più diffusa, Schistosoma mansoni, è geograficamente distribuita in Sud America, l'arcipelago dei Caraibi, Medio Oriente e Africa sub-sahariana2. Il ciclo di vita di S. mansonie altri schistosomes, è complesso, che coinvolge un mammifero ospite definitivo e lumache d'acqua dolce del genere Biomphalaria che fungono da ospiti intermedi obbligati.
S. mansoni....
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Protocollo
Tutti cura degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso della University of Wisconsin-Madison sotto protocollo istituzionale Animal Care e non. V005717. Il seguente protocollo comporta lavorare in una struttura di livello 2 di biosicurezza (BSL2) per agenti patogeni umani, anche se nessuna delle fasi di schistosome raffigurate in questo protocollo sono infettiva per l'uomo o altri mammiferi. Seguire politiche istituzionali per la gestione degli agenti patogeni umani del gruppo di rischio 2 (RG2).
Nota: Usiamo topi femmina Swiss-Webster (6 - settimana vecchi) a causa della loro maggiore suscettibilità all'i....
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Risultati
La stragrande maggioranza dei miracidia in genere vi sono state raccolte nei primi due "raccolti". Incubazione di miracidia isolato in CBSS + innesca il processo di trasformazione di miracidium-a-sporociste (Figura 4A- C). Entro la prima ora seguente trasferimento alla cultura pozzetti contenente CBSS +, la maggior parte di cessare miracidia nuoto (Figura 4A). A 6 h nella cultura, miracidia stanno attivamente spa.......
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Discussione
Miracidia di S. mansoni, isolato e manipolato come descritto nel presente documento, può infettare solo l'ospite intermedio di lumaca e pertanto non rappresentano un rischio biologico umano durante questa fase di sviluppo larvale. Tuttavia, per evitare l'accidentale esposizione/infezione di lumache, dovrebbe prestare attenzione per eseguire gli isolamenti miracidial in una posizione diversa dalle zone dove la specie di lumaca Biomphalaria sensibili possono essere presente o mantenuto. Una stanza separat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Finanziato in parte dalla concessione NIH RO1AI015503. Topi infettati di schistosome erano forniti dal NIAID schistosomiasi Resource Center presso l'Istituto di ricerca biomedica (Rockville, MD) attraverso NIH-NIAID contratto HHSN272201000005I per la distribuzione attraverso le risorse della BEI.
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Materiali
2
Bge incompleto ... di eutanasia per topi Topi Taconic Biosciences Swiss-Webster, femmina, 6 settimane, murina CO piastra per priva di agenti patogeni volumetrici da 1 LProvette da centrifuga
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina bilanciata di chernin (CBSS+) | Per 1 litro di soluzione | ||
| 2,8 g di cloruro di sodio | Fisher Scientific | S271-3 | Sciogliere i sali, tranne il cloruro di calcio, e |
| 0,15 g di cloruro di potassio | Zuccheri Sigma-Aldrich | P5405 | in 800 mL ddH2O |
| 0,07 g di fosfato di sodio, bibasico anidro | Fisher | Scientific S374-500 | Sciogliere separatamente il cloruro di calcio in 200 |
| 0,45 g di solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0,53 g cloruro di calcio diidrato | Mallinckrodt | 4160 | Aggiungere lentamente il soln di calcio al soln di sale/zucchero con |
| 0,05 g di bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | S233-3 | con miscelazione costante |
| 1 g di glucosio | MP Biomedicals | 152527 | Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con filtro |
| 1 g trealosio | Sigma-Aldrich | T0167 | 0,22 µ m filtro monouso per flaconi |
| 10 mL 100X penicillina/streptomicina | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina filtrata e streptomicina soln uso precedente |
| Incompleto Bge medium (Ibge) | Per 900 mL di soluzione | ||
| 220 mL Schneider' s Terreno di coltura Drosophila modificato | Lonza | 04-351Q | Miscelare il terreno di Schneider con 680 mL di ddH2O |
| 4,5 g di idrolizzato enzimatico di lattoalbumina | Sigma-Aldrich | L9010 | Aggiungere idrolizzato di lattoalbumina e galattosio |
| 1,3 g di galattosio | Sigma-Aldrich | G0625 | Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con un filtro 0,22 &; m Filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi |
| Terreno Bge completo (cBge)< | forte>Per 100 mL di soluzione | ||
| 90 mL Terreno | Per inattivare a caldo FBS: Incubare FBS scongelato in | ||
| 9 mL di siero fetale bovino (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | bagnomaria a 60 gradi; C per 1 ora mentre delicatamente |
| 1 mL di 100X penicillina/streptomicina | Hyclone | SV30010 | agitando il flacone ogni 10 min Aliquot FBS inattivato a caldo in provette da 15 mL. e conservare a -20 gradi C. Miscelare il terreno + FBS e filtro, sterilizzare utilizzando un 0,22 & micro; m pre-sterilizzato filtro monouso per flaconi Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| Acqua di stagno (soluzione madre) | 1 litro di soluzione madre | ||
| 12,5 g di carbonato di calcio | Fisher Scientific | C64-500 | Mescolare tutti i sali in 1 litro di ddH2O |
| 1,25 g di carbonato di magnesio | Fisher Scientific | M27-500 | Si noti che i sali non avranno completamente |
| 1,25 g di cloruro di sodio | Fisher Scientific | S271-3 | disciolto. Agitare energicamente per sospendere |
| 0,25 g di sali di cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P5405 | prima di effettuare la lavorazione |
| Acqua del laghetto (soluzione di lavoro) | 1,5 L di soluzione | ||
| 0,8 ml di acqua madre del laghetto (agitare prima dell'uso) in | Miscelare il brodo con ddH2O | ||
| 1500 mL di ddH2O | Sterilizzare l'acqua del laghetto mediante sterilizzazione in autoclave (lento | ||
| 1,5 ml di penicillina/streptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| (1,2% NaCl) | 1,5 L di soluzione | ||
| 18 g di cloruro di sodio in 1500 mL di ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Soluzione salina per autoclave per sterilizzare |
| 1,5 mL di penicillina/streptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| Attrezzature e materiali aggiuntivi: Camera | |||
| 7-L | A seguito del protocollo IACUC approvato n. V001551 | ||
| Serbatoio e regolatore | |||
| coltura tissutale a 24 pozzetti | TPP | 92424 | |
| Palloni | |||
| Sorgente luminosa (150W) | Chiu Tech Corp | Modello F0-150 | |
| Centrifuga, refrigerata, secchio oscillante | Centrifuga Eppendorf | Modello 5810R | |
| flaconi (250 mL) | Nalgene | ||
| da 15 mL, sterili | Corning | 430053 | |
| Pipette di trasferimento monouso sterili | Fisher Scientific 1371120 | ||
| 0,22 & micro; m filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Frullatore in acciaio inossidabile | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Tazza frullatore, capacità 100 mL | Waring Commercial | ||
| Microscopio composto invertito | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
Riferimenti
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts.
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Ristampe e permessi
