Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l'introduzione in coltura in vitro .
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Articolo metodologico
Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umani sangue trematodi, Schistosoma spp., hanno un ciclo di vita complesso che coinvolge fasi dello sviluppo sessuale e asessuale all'interno di un lumaca intermedi e di mammifero ospite finale, rispettivamente. La capacità di isolare e sostenere le fasi del ciclo di vita diverso in condizioni di coltura in vitro ha notevolmente facilitato le indagini dei meccanismi cellulari, biochimici e molecolari che regolano l'host, la sviluppo e la crescita del parassita interazioni farmacologiche. Trasmissione della schistosomiasi richiede la riproduzione asessuata e lo sviluppo di più stadi larvali all'interno dell'host lumaca; dal miracidium infettiva, attraverso sporocisti primarie e secondarie, alla fase finale cercarial che è infettivo agli esseri umani. In questa carta presentiamo un protocollo passo-passo per massa schiusa e isolamento di Schistosoma mansoni miracidia da uova ottenute dai fegati di topi infetti e la loro successiva introduzione in coltura in vitro . Si prevede che il protocollo dettagliato incoraggerà nuovi ricercatori per partecipare e ampliare questo importante settore della ricerca di schistosome.
Introduzione
L'essere umano sangue flukes Schistosoma spp., sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia tropicale trascurata che affligge un stimato 230 milioni di persone in tutto il mondo1. La specie più diffusa, Schistosoma mansoni, è geograficamente distribuita in Sud America, l'arcipelago dei Caraibi, Medio Oriente e Africa sub-sahariana2. Il ciclo di vita di S. mansonie altri schistosomes, è complesso, che coinvolge un mammifero ospite definitivo e lumache d'acqua dolce del genere Biomphalaria che fungono da ospiti intermedi obbligati.
S. mansoni adulto maschio e femmina a vite senza fine coppie vivono nelle vene mesenteriche posteriore di riprodurre il mammifero ospite, determinando il rilascio di uova embrionate (ovuli) che sono alloggiati in piccole venule della mucosa intestinale. Uova quindi rotture attraverso le pareti del vaso, migrano attraverso il tessuto mucoso e alla fine inserire il lume intestinale dove essi sono annullate con le feci. Quando gli ovuli digitare tratteggio di larve d'acqua dolce e liberamente natante (miracidia), devono, in breve tempo, trovare una lumaca Biomphalaria adatta per infettare al fine di continuare il suo ciclo di vita. Questo processo di infezione coinvolge miracidial attaccamento alla superficie esterna di lumaca seguita da penetrazione attiva e voce della larva nell'ospite. Presto dopo l'entrata, il miracidium inizia a capannone relative piastre epidermiche ciliati esterni come si forma un sincizio che diventerà la nuova superficie esterna (tegumento) della prossima fase larvale, lo sporociste primario o madre. Attraverso la riproduzione asessuata, ogni sporociste primario produce e rilascia una seconda generazione di sporocisti, definiti secondari o sporocisti di figlia, che a sua volta, generano e rilasciare grandi quantità di intramolluscan fase finale, le cercarie di Fasciolopsis3 . Al momento della fuga dall'host lumaca, liberamente natante cercarie sono capaci di associare a e direttamente penetrando la pelle di un uomo o altri host mammiferi adatto. All'entrata in loro nuovo ospite, cercarie trasformano alla fase schistosomula parassitarie e invadono il sistema vascolare. Essi, a loro volta, migrare al polmone e quindi alla vena epatica dove maturano in vermi adulti, formano coppie maschili e femminile e viaggiare a vene mesenteriche per completare il loro ciclo di vita.
Successo intramolluscan o "fase di lumaca" sviluppo larvale schistosomes è essenziale per la continuazione del ciclo di trasmissione interumana host-to-host. Di fondamentale importanza è la seguente voce periodo del miracidium liberamente natante in host lumaca e la sua trasformazione iniziale alla fase primaria sporociste. A seconda della compatibilità fisiologica e immunologica tra ospite e parassita, è durante questa fase di sviluppo larvale che iniziale successo o il fallimento di stabilire infezioni è determinato4,5,6 . Lo sviluppo successivo di sporocisti primari in grado di produrre asessualmente sporocisti secondari, che quindi generano cercarie umani-infettivo, ulteriormente richiedono un ambiente di host fisiologico permissiva che fornisce per tutta crescita del parassita e riproduttiva ha bisogno.
Fin qui, piccolo è conosciuto circa il sottostante fisiologici, biochimici e processi molecolari controllare interazioni di schistosome-lumaca, soprattutto le molecole e vie coinvolte nella regolazione della riproduzione e sviluppo larvale o modulante risposta immune dell'ospite. Pronto accesso a un gran numero di questi stadi larvali in vitro condizioni di coltura che permettono la manipolazione sperimentale faciliterebbe notevolmente alla scoperta delle vie di sviluppo e meccanismi di fondo della crescita cellulare, differenziazione e riproduzione. Percorsi critici parassita o meccanismi, identificati attraverso la sperimentazione in vitro , quindi potrebbero essere utilizzati per interrompere la crescita/riproduzione larvale nell'host di lumaca, o per identificare meccanismi immuni dell'ospite lumaca coinvolti nel riconoscimento e nell'eliminazione di fasi miracidial o sporociste.
In questo articolo e il video di presentazione, forniamo una descrizione dettagliata di un metodo per isolare un numero elevato di nuotare liberamente S. mansoni miracidia per introduzione nella cultura in vitro che poi può essere sottoposto a follow-up sperimentale manipolazione (vedere la Figura 1 per una descrizione schematica del flusso di lavoro di protocollo). Anche se le procedure simili sono state descritte in precedenza7,8,9, abbiamo sentito che un protocollo dettagliato sarebbe utile per i ricercatori che desiderano impiegare questo modello per affrontare domande ancora senza risposta legate alla lo sviluppo larvale intramolluscan, proliferazione cellulare e interazioni immuni di schistosome-lumaca. Inoltre, questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l'isolamento delle uova da altri trematodi medicamente importanti quali vescica-dimora S. haematobium, distomi del fegato o trematodi del polmone.
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Protocollo
Tutti cura degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso della University of Wisconsin-Madison sotto protocollo istituzionale Animal Care e non. V005717. Il seguente protocollo comporta lavorare in una struttura di livello 2 di biosicurezza (BSL2) per agenti patogeni umani, anche se nessuna delle fasi di schistosome raffigurate in questo protocollo sono infettiva per l'uomo o altri mammiferi. Seguire politiche istituzionali per la gestione degli agenti patogeni umani del gruppo di rischio 2 (RG2).
Nota: Usiamo topi femmina Swiss-Webster (6 - settimana vecchi) a causa della loro maggiore suscettibilità all'infezione10, ottenendo quindi più grandi oneri di uovo. Tucker et al. descrivere i protocolli di infezione mouse e lumaca utilizzati in questo modello sistema11. La Tabella materiali elenca tutte le attrezzature specifiche, materiali, reagenti e fonti animali necessari per svolgere questo protocollo sperimentale.
1. il trattamento dei fegati infetti
- Eutanasia topi, post-infezione 6-7 settimane, da asfissia di CO2 (tasso di 10-30% del volume della camera al minuto). Topi di monitor per la cessazione della respirazione e battito cardiaco.
Nota: In genere fino a 20 topi possono essere elaborati in un dato momento. - Dopo aver trasferito eutanasizzati topi una cappa di biosicurezza, posizionare il mouse sulle loro spalle e spruzzare loro superfici ventrale con etanolo al 70%. Lasciate macerare per 1 min.
- Pizzicare e tirare la pelle dell'addome più basso e tagliare tutta la base della pelle pizzicata più vicina all'addome con forbici chirurgiche sterili. Tirare la pelle tagliata anteriormente (cioè, verso la testa) per rivelare il fegato. Si noti che il fegato dovrebbe essere ampliato e screziato dovuto una risposta granulomatosa indotta da uovo (Figura 2A).
- Rimuovere il fegato e posizionarlo in un becher contenente 200 mL di sterile 1,2% NaCl soluzione contenente pen/strep.
- Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.4 con topi restanti.
Nota: Venti topi sono generalmente trattati in un solo raccolto. - Posizionare i fegati in una capsula di Petri sterile e rimuovere non-fegato grasso/connettivo con pinze sterili.
- Trasferimento fegatini tagliati/puliti in una bottiglia sterile 250 mL Centrifuga contenente ~ 200 mL di soluzione sterile di NaCl 1,2% con penna/strep.
- Vigorosamente agitare il flacone contenente i fegati e, utilizzando una pipetta monouso sterile, rimuovere la superficie in eccesso schiuma/detriti galleggianti. Lentamente versare fuori la soluzione salina rimanente in un contenitore o affondare contenenti candeggina 1% (disinfettante).
- Aggiungi ~ 200 mL di soluzione salina fresca per i fegati e ripetere il passaggio 1.8 tre volte di più.
2. fegato isolamento di estrazione e miracidial
- Inserire i fegatini in una tazza piccola sterili in acciaio inox frullatore e aggiungere ~ 2 mL di soluzione di 1,2% di NaCl (Figura 2B).
- Coprire la tazza con un foglio e una capsula di Petri di evitare fuoriuscite e mescolare per 1 min dall'alternarsi di bassa e alta velocità (20 s bassa velocità/10 s ad alta velocità; ripetizione) (Figura 2).
- Distribuire uniformemente la sospensione del fegato blended in bottiglie sterili 250 mL centrifuga (per 20 fegati utilizzano 4 bottiglie).
- Aggiungere soluzione fisiologica sterile con antibiotici a ~ 200 mL bottiglia/volume totale. Pesare/equilibrio bottiglie prima della centrifugazione.
- Centrifugare i fegati mescolati a 290 x g per 15 min a 4 oC. delicatamente versare i surnatanti in un contenitore con candeggina prima dello smaltimento.
- Ripetere i passaggi da 2.4-2.5 una volta. Essere sicuri Risospendere accuratamente sedimento del fegato prima della centrifugazione.
- Dopo aver scartato l'ultima soluzione fisiologica lavare (passo 2,6), aggiungere 200 mL di acqua sterile stagno con penna/strep al tessuto del fegato pellettato, agitare per risospendere il sedimento e trasferire la sospensione in un pallone volumetrico da sterilizzata a 1-L che è stato completamente rivestito di alluminio lamina, fatta eccezione per la parte superiore 3 cm del collo (Figura 2D).
Nota: Utilizzare due bottiglie (= 10 fegati) per 1-L fiaschetta. Laghetto d'acqua simula l'ambiente d'acqua dolce naturale necessaria per stimolare miracidial Cova da uova. - Utilizzando acqua sterile dello stagno, riempire il matraccio a circa 3 cm sopra la lamina che copre il collo. Poi, senza ritardo (come miracidia presto cominciano a covare), rimuovere la schiuma residua e tessuto del fegato galleggiante alla superficie pipettando rapidamente fino ~ 12 mL di acqua di stagno contenente detriti e scartando in un separato scartare il tubo. Sostituire con acqua fresca e sterile dello stagno.
- Ripetere la pulizia passo 2.8, altre tre volte, verificare presenza di miracidia nel tubo di scartare. Cessare la ripetizione della fase di pulizia se miracidia appaiono nella soluzione di lavaggio.
- Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere lentamente ~ 12 mL di acqua calda sterile stagno (pre-riscaldato a 30 oC) per creare un gradiente di temperatura con acqua tiepida pulita e sterile sulla parte superiore.
Nota: Ciò avviene meglio scaricando lentamente l'acqua lungo il lato del collo per evitare di miscelare boccetta. - Posizionare una piccola capsula di Petri copertura sopra l'apertura della boccetta e brillare una luce brillante nella parte superiore del pallone sopra la pellicola di copertura per illuminare la superficie superiore dell'acqua.
Nota: In genere, entro 5-10 min, nuoto miracidia, attirata dalla luce, si concentrerà in gran numero entro i primi 2-3 cm di acqua di stagno (Figura 3A).
3. Miracidial raccolta e coltivazione
- Quando miracidia hanno accumulato sulla superficie dopo 10 min, utilizzando una pipetta da trasferimento sterile, rimuovere ~ 8 mL di acqua di stagno e trasferirlo in una provetta sterile 15 mL centrifuga. Collocare la provetta contenente miracidia sul ghiaccio.
- Aggiungere posteriore 8 mL di acqua calda sterile stagno lungo l'interno del matraccio tarato e attendere altri 10 min.
- Utilizzando tubi di nuovi ogni volta, ripetere i passaggi da 3.1 e 3.2 altre tre volte. Dopo la raccolta dith 4, tenere il tubo finale in ghiaccio per 10 minuti consentire la miracidia a stabilirsi. Questo set di tubi comprende il primo raccolto.
- Centrifugare le provette contenenti miracidia a 290 x g per 1 min a 4 oC in una centrifuga refrigerata pre-raffreddata.
- Rimuovere immediatamente la maggior parte del surnatante (~ 7 mL) facendo attenzione a non disturbare il pellet di parassita (Figura 3B).
- Piscina tutti la miracidia da questo primo raccolto in un unico tubo, quindi sciacquare tutti i tubi originali con ~ 1 mL di acqua sterile stagno e aggiungere alla provetta del "pool".
- Consentire i parassiti a stabilirsi sul ghiaccio per ~ 5 min e centrifugare nuovamente i parassiti a 290 x g per 1 min a 4 oC.
- Con attenzione rimuovere il supernatante e aggiungere che 6-8 mL sterile Chernin equilibrata soluzione salina (CBSS +; Vedi tabella materiali) contenente pen/strep.
- Delicatamente sospendere la miracidia e aliquota in una piastra di coltura 24 pozzetti (1 mL per pozzetto), seguita dal tubo di risciacquo in 6-8 mL CBSS + e aggiungendo 1 mL di risciacquo in ciascun pozzetto. Incubare i parassiti a 26 oC in condizioni di normossia. Concentrazioni di miracidia isolato potranno variare, ma generalmente in media ~ 7000/mL.
- Se i parassiti sono ancora concentrato presso la sorgente di luce, ripetere i passaggi 3.1 a 3.9 per continuare la raccolta tardiva-cova miracidia ma aumentare l'intervallo di tempo tra le raccolte per 15-20 min.
Nota: Questo nuovo set di tubi rappresenta la seconda raccolta. Tuttavia, poiché i numeri miracidial sono in genere Bassi, larve da tutte le provette di solito sono raggruppate in un'unica cultura ben contenenti 2 mL CBSS +. - Alle 24 ore post-raccolta e coltivazione, Risospendere delicatamente sporocisti nei loro pozzi di pipettaggio.
- Attendere qualche minuto per consentire i parassiti a depositarsi sul fondo dei pozzetti. Una volta che si sono insediati, rimuovere con cautela il surnatante (~1.5 mL), che conterrà la maggior parte delle piastre epidermiche ciliate capannone da miracidia durante la trasformazione larvale. Questa "trasformazione" supernatante può essere scartata o incorporata in studi di follow-up di prodotti secretivi larvali.
- Aggiungere 1,5 mL di fresco CBSS + in ciascun pozzetto e delicatamente pipetta per risospendere sporocisti. Ripetere il passaggio 3.12 se si desidera ulteriore lavaggio o cambiando in un supporto diverso.
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Risultati
La stragrande maggioranza dei miracidia in genere vi sono state raccolte nei primi due "raccolti". Incubazione di miracidia isolato in CBSS + innesca il processo di trasformazione di miracidium-a-sporociste (Figura 4A- C). Entro la prima ora seguente trasferimento alla cultura pozzetti contenente CBSS +, la maggior parte di cessare miracidia nuoto (Figura 4A). A 6 h nella cultura, miracidia stanno attivamente spa...
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Discussione
Miracidia di S. mansoni, isolato e manipolato come descritto nel presente documento, può infettare solo l'ospite intermedio di lumaca e pertanto non rappresentano un rischio biologico umano durante questa fase di sviluppo larvale. Tuttavia, per evitare l'accidentale esposizione/infezione di lumache, dovrebbe prestare attenzione per eseguire gli isolamenti miracidial in una posizione diversa dalle zone dove la specie di lumaca Biomphalaria sensibili possono essere presente o mantenuto. Una stanza separat...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Finanziato in parte dalla concessione NIH RO1AI015503. Topi infettati di schistosome erano forniti dal NIAID schistosomiasi Resource Center presso l'Istituto di ricerca biomedica (Rockville, MD) attraverso NIH-NIAID contratto HHSN272201000005I per la distribuzione attraverso le risorse della BEI.
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Materiali
2
Bge incompleto ... di eutanasia per topi Topi Taconic Biosciences Swiss-Webster, femmina, 6 settimane, murina CO piastra per priva di agenti patogeni volumetrici da 1 LProvette da centrifuga
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina bilanciata di chernin (CBSS+) | Per 1 litro di soluzione | ||
| 2,8 g di cloruro di sodio | Fisher Scientific | S271-3 | Sciogliere i sali, tranne il cloruro di calcio, e |
| 0,15 g di cloruro di potassio | Zuccheri Sigma-Aldrich | P5405 | in 800 mL ddH2O |
| 0,07 g di fosfato di sodio, bibasico anidro | Fisher | Scientific S374-500 | Sciogliere separatamente il cloruro di calcio in 200 |
| 0,45 g di solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0,53 g cloruro di calcio diidrato | Mallinckrodt | 4160 | Aggiungere lentamente il soln di calcio al soln di sale/zucchero con |
| 0,05 g di bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | S233-3 | con miscelazione costante |
| 1 g di glucosio | MP Biomedicals | 152527 | Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con filtro |
| 1 g trealosio | Sigma-Aldrich | T0167 | 0,22 µ m filtro monouso per flaconi |
| 10 mL 100X penicillina/streptomicina | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina filtrata e streptomicina soln uso precedente |
| Incompleto Bge medium (Ibge) | Per 900 mL di soluzione | ||
| 220 mL Schneider' s Terreno di coltura Drosophila modificato | Lonza | 04-351Q | Miscelare il terreno di Schneider con 680 mL di ddH2O |
| 4,5 g di idrolizzato enzimatico di lattoalbumina | Sigma-Aldrich | L9010 | Aggiungere idrolizzato di lattoalbumina e galattosio |
| 1,3 g di galattosio | Sigma-Aldrich | G0625 | Regolare a pH 7,2 e sterilizzare con un filtro 0,22 &; m Filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi |
| Terreno Bge completo (cBge)< | forte>Per 100 mL di soluzione | ||
| 90 mL Terreno | Per inattivare a caldo FBS: Incubare FBS scongelato in | ||
| 9 mL di siero fetale bovino (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | bagnomaria a 60 gradi; C per 1 ora mentre delicatamente |
| 1 mL di 100X penicillina/streptomicina | Hyclone | SV30010 | agitando il flacone ogni 10 min Aliquot FBS inattivato a caldo in provette da 15 mL. e conservare a -20 gradi C. Miscelare il terreno + FBS e filtro, sterilizzare utilizzando un 0,22 & micro; m pre-sterilizzato filtro monouso per flaconi Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| Acqua di stagno (soluzione madre) | 1 litro di soluzione madre | ||
| 12,5 g di carbonato di calcio | Fisher Scientific | C64-500 | Mescolare tutti i sali in 1 litro di ddH2O |
| 1,25 g di carbonato di magnesio | Fisher Scientific | M27-500 | Si noti che i sali non avranno completamente |
| 1,25 g di cloruro di sodio | Fisher Scientific | S271-3 | disciolto. Agitare energicamente per sospendere |
| 0,25 g di sali di cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P5405 | prima di effettuare la lavorazione |
| Acqua del laghetto (soluzione di lavoro) | 1,5 L di soluzione | ||
| 0,8 ml di acqua madre del laghetto (agitare prima dell'uso) in | Miscelare il brodo con ddH2O | ||
| 1500 mL di ddH2O | Sterilizzare l'acqua del laghetto mediante sterilizzazione in autoclave (lento | ||
| 1,5 ml di penicillina/streptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| (1,2% NaCl) | 1,5 L di soluzione | ||
| 18 g di cloruro di sodio in 1500 mL di ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Soluzione salina per autoclave per sterilizzare |
| 1,5 mL di penicillina/streptomicina 100X | Hyclone | SV30010 | Aggiungere penicillina e streptomicina prima dell'uso |
| Attrezzature e materiali aggiuntivi: Camera | |||
| 7-L | A seguito del protocollo IACUC approvato n. V001551 | ||
| Serbatoio e regolatore | |||
| coltura tissutale a 24 pozzetti | TPP | 92424 | |
| Palloni | |||
| Sorgente luminosa (150W) | Chiu Tech Corp | Modello F0-150 | |
| Centrifuga, refrigerata, secchio oscillante | Centrifuga Eppendorf | Modello 5810R | |
| flaconi (250 mL) | Nalgene | ||
| da 15 mL, sterili | Corning | 430053 | |
| Pipette di trasferimento monouso sterili | Fisher Scientific 1371120 | ||
| 0,22 & micro; m filtro monouso pre-sterilizzato per flaconi | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Frullatore in acciaio inossidabile | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Tazza frullatore, capacità 100 mL | Waring Commercial | ||
| Microscopio composto invertito | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
Riferimenti
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