Articolo metodologico

Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

DOI:

10.3791/56385

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6 gennaio 2018

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1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive le tecniche per la valutazione di reticolazione chimica dello sclera coniglio mediante generazione di seconda armonica imaging e Calorimetria a scansione differenziale.

Abstract

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Metodi per rinforzare il tessuto introducendo legami chimici (cross-linking non enzimatica) in proteine strutturali (collageni fibrillari) per la terapia includono cross-linking fotochimico e cross-linking metodi (TXL) del tessuto. Tali metodi per indurre i cambiamenti di proprietà meccaniche del tessuto sono essere impiegati per la cornea nei disordini di assottigliamento corneale (meccanicamente indebolito) come cheratocono, nonché la sclera in miopia progressiva, dove diradamento e indebolimento del posteriore sclera si verifica e probabilmente contribuisce all'allungamento assiale. Le proteine bersaglio primario per tale rafforzamento del tessuto sono collageni fibrillari che costituiscono la grande maggioranza delle proteine di peso a secco nella cornea e sclera. Fortuitamente, collageni fibrillari sono la principale fonte di seconda generazione armonica segnali nello spazio extracellulare dei tessuti. Pertanto, modificazioni delle proteine del collagene, quali quelli indotti tramite cross-linking terapie, potenzialmente potrebbero essere rilevate e quantificate attraverso l'uso di microscopia di seconda generazione di armoniche (SHGM). Monitoraggio SHGM segnali attraverso l'uso di un sistema di microscopia accoppiato con un'eccitazione a infrarossi luce di scansione laser di origine è un metodo di imaging moderno emozionante che sta godendo l'uso diffuso nelle scienze biomediche. Così, lo studio presente è stato intrapreso per valutare l'uso di microscopia SHGM come un mezzo per misurare indotta cross-linking effetti ex vivo la sclera di coniglio, segue un'iniezione di una sostanza chimica agente reticolante nello spazio di sub-Tenon (sT), un iniezione di approccio che è pratica standard per causare anestesia oculare durante le procedure cliniche oftalmologiche. La chimica agente reticolante, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), è da una classe di conservanti cosmetici conosciuto come formaldeide distaccanti (FARs). Cambiamenti scleral dopo reazione con SMG provocato gli aumenti in SHG segnali e correlati con i cambiamenti nella temperatura di denaturazione termica, un metodo standard per valutare indotta cross-linking effetti del tessuto.

Introduzione

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Miopia progressiva è postulata per essere curabile attraverso reticolazione scleral non enzimatici (fotochimica e/o chimica), che ha un senso dato che bloccando la reticolazione del collagene enzimatica può aumentare la privazione di forma sperimentale (FD)-indotta miopia1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discusso la fattibilità e il potenziale di utilizzo standard irradiazione ultravioletta-A (UVA)-riboflavina mediata reticolazione fotochimica (noto anche come il protocollo di Dresda), abbreviato qui come (riboflavina CXL) per stabilizzazione scleral posteriore fermare allungamento assiale nella miopia. Questo metodo ....

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state effettuate utilizzando gli occhi dei conigli cadaverico all'interno di teste di coniglio nazionali intatto. Sono state seguite tutti istituzionale e nazionale le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. preparazione delle soluzioni

  1. Preparazione di SMG per TXL:
    1. Preparare 1 mL di concentrazione di 0,2 M di soluzione di bicarbonato di sodio soluzione (NaHCO3) utilizzando 0,0165 g di NaHCO3 polvere disciolta in 1 mL di acqua distillata.
    2. Sciogliere 0,1016 mg di sodio in polvere hydroxymethylglycinate (SMG) in 1 mL di acqua distillata per ottenere una co....

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Risultati

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Temperatura di denaturazione termica (Tm) come un metodo di dosaggio per valutare TXL cross-linking effetto: Un totale di 16 paia di occhi di coniglio sono stati utilizzati in questi esperimenti per la procedura TXL. Come una parte iniziale di questo studio, è stata valutata la localizzazione di cross-linking effetto indotto tramite una singola iniezione di agente reticolante SMG via sT spazio alla testa di coniglio cadaverico. Questo tipo di esperimento ha rilevanza per .......

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Discussione

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Esperimenti condotti hanno dimostrato la prova sostiene l'uso di microscopia SHG segnale come un metodo per la valutazione di cross-linking effetti sclera, sollevando la possibilità futura di usare questa tecnica come strumento di monitoraggio per trattamenti di cross-linking del collagene che destinazione proteine del collagene. Della nota, uno strumento è già in uso clinico che potenzialmente in grado di catturare questo segnale SHG. Anche se questo strumento è stato progettato principalmente per imaging derma di pelle.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Tongalp Tezel, MD, per la consultazione per quanto riguarda sT iniezione; Theresa Swayne, PhD, di consultazione in proposito SHG microscopia; e Jimmy Duong dal Design e Biostatistica risorsa e la funzione di memoria di biostatistica dell'Irving Institute presso la Columbia University Medical Center.

Supportato in parte dalla ricerca per prevenire la cecità e da istituti nazionali di salute sovvenzioni NCRR UL1RR024156, nia P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possiede proprietà intellettuale correlati: US rilasciati brevetti no: 8.466.203 e no: 9.125.856. In attesa di brevetto in....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SINTESI MILLI-Q A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USAAcqua deionizzata a doppia distillazione. - fase del protocollo 1.1.1
Idrossimetilglicinato di sodio Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USAReagente reticolante - fase del protocollo 1.1.2
Ago per iniezione con siringa luer-lockBD Eclipse, NJ, USASiringa per iniezione di subtenone. - fase del protocollo 2.1
Testa di coniglioPollame La Granjadi razza separatae consegnata entro 1 ora post mortem. - fase del protocollo 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYMisure IOP - fase del protocollo 2.4
Autocampionatore DSC 6000Perkin-Elmer Waltham, MA, USAAnalizzatore di denaturazione termica - fase del protocollo 7.4
Software Piris Perkin-Elmer, Waltham, MA, Stati UnitiVer 11.0  passo del protocollo 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAUn obiettivo a immersione in acqua con elevata trasmittanza IR con una distanza di lavoro di 2,0 mm - passo del protocollo 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, Texas.B000URVDQ8Gel a base d'acqua utilizzato come mezzo di immersione oggettivo al posto dell'acqua per prevenire l'evaporazione - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara, CA, USALaser pulsato Ti:Zaffiro con una larghezza di impulso di 140 fs a 80 MHz e un intervallo di regolazione da 680 nm a 1080 nm. - fase del protocollo 8.1.11
Camera cellulare AttoFluorThermo Fisher Scientific IncA7816Fissazione del vetrino coprioggetto - fase del protocollo 8.1.3
Vetrini coprioggetti rotondi da 25 mm, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, Protocollo USAGG-25-1.5passaggio 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, passaggio del protocollo USA8.1.4.
Rivelatore GaAsP non descansionato (NDD)Nikon Instruments, Melville, NY, USADotato di un filtro passa-banda da 400-450 nm - passaggio del protocollo 8.1.7
Sistema di scansione laser A1R-MPNikon Instruments, Melville, NY, USACompatibile con l'eccitazione multifotone a infrarossi (IR). - passaggio del protocollo 8.1.8
Software NIS ElementsNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3indicato come "software" nel testo - protocollo passo 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health  fase del protocollo 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassihttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, per la fase del protocollo 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 149.2.8
Testa di coniglio Passaggio del protocollo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Op....

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Microscopia SHGCalorimetria a scansione differenzialeIniezione sub tenoneFibrille di collageneAgente a rilascio di formaldeideMicroscopia laser a scansioneDenaturazione termica

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