Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.
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Articolo metodologico
Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali embrionali (ES) hanno la capacità di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre strati germinali (ectoderma, mesoderma o endoderma) e possono generare molti lignaggi per la medicina rigenerativa. ES cella cultura in vitro è stata a lungo oggetto di diffuse preoccupazioni. Classicamente, le cellule di topo ES sono mantenute in fattore inibitorio di leucemia e del siero (LIF)-che contiene il media. Tuttavia, in condizioni di siero/LIF, cellule mostrano eterogeneità nella morfologia e il profilo di espressione di geni correlati alla pluripotenza e sono per lo più in uno stato metastabile. Inoltre, cellule ES coltivate presentano ipermetilazione globale, ma ingenuo ES le cellule della massa cellulare interna (ICM) e cellule germinali primordiali (PGC) sono in uno stato di hypomethylation globale. Lo stato di ipometilato di ICM e PGC è associato molto attentamente con loro pluripotenza. Per migliorare i metodi di coltura cellulare di topo ES, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo metodo basato sull'utilizzazione selettivamente combinata di due composti di piccole molecole per mantenere lo stato di DNA ipometilato e pluripotenti. Qui, vi presentiamo che il co-trattamento di vitamina C (Vc) e PD0325901 può cancellare circa il 90% di 5-metilcitosina (5mC) a 5 giorni in cellule di topo ES. Il contenuto generato 5mC è paragonabile a quella di PGC. L'indagine meccanicistica dimostra che PD0325901 in su-regola l'espressione di Prdm14 per sopprimere Dnmt3b (de novo del DNA metiltransferasi) e Dnmt3l (il cofattore di Dnmt3b), riducendo la sintesi de novo del 5mC. VC facilita la conversione di 5mC a 5-idrossimetilcitosina (5hmC) catalizzata principalmente da Tet1 e Tet2, indicante la partecipazione di demethylations di DNA sia passive che attive. Inoltre, in condizioni di Vc/PD0325901, cellule di topo ES mostrano morfologia omogenea e stato pluripotent. Collettivamente, vi proponiamo un nuovo e metodo di cultura chimica-sinergia per il raggiungimento ipometilazione del DNA e mantenimento della pluripotenza in cellule di topo ES. Il metodo chimico-dipendente della piccolo-molecola sormonta le imperfezioni più importanti della cultura del siero e detiene promessa per generare cellule ES omogenee per ulteriori applicazioni cliniche e ricerche.
Introduzione
Le cellule ES sono originate da ICM di una blastocisti1. Le cellule sono in uno stato di pluripotenza e possono formare tutti i lignaggi somatici e germinale celle2. Istituzione di cellule ES fornisce la possibilità di indagare lo sviluppo processi in vitro e in grado di generare cellule di rilevanza medica per la medicina rigenerativa basata sul loro pluripotenza3.
Due gruppi intaccata stabilito le linee di cellule di topo ES nel 1981 e quando le cellule derivate dal primo embrione di topo sono state coltivate in siero bovino fetale (FBS)-che contiene il media....
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Protocollo
1. preparati
-
Preparare una soluzione di 1,0 mM PD0325901 (inibitore di MEK) e 3,0 mM CHIR99021 (inibitore di GSK3).
- Pesare 2 mg di PD0325901 e aggiungere 4,15 mL di DMSO in un flacone di vetro ambrato.
- Pesare 2 mg di CHIR99021 e aggiungere 1,43 mL di DMSO in un flacone di vetro ambrato.
- Seguente la ricostituzione, conservare le aliquote (50 µ l/tubo in provette per PCR 200 µ l) a-20 ° C e al riparo dalla luce. Rimuovere una provetta contenente il brodo congelato da un e scongelare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Pesare 0,0176 g di Vc in 1 mL di una provetta da centrifuga e si ric....
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Risultati
VC/PD0325901 indotto sinergicamente la cancellazione globale delle cellule di topo ES. Cellule di topo ES in siero esibiscono ipermetilazione del DNA, mentre le cellule pluripotenti ICM e PGC mostrano la cancellazione globale di metilazione del DNA e lo stato di ipometilato è associato molto attentamente con loro pluripotenza9,10.
In precedenza, noi ed altri trovato che .......
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Discussione
Nel lavoro, abbiamo dimostrato un metodo novello di combinando Vc e PD0325901 per sostenere le cellule di topo ES a uno stato indifferenziato e ipometilato, che è stato raggiunto da un'azione sinergica di promuovere la demetilazione del DNA di Vc e soppressione de novo del DNA metilazione di PD0325901. Inoltre, cellule di topo ES ha mostrato grande morfologia sotto il sistema di coltura Vc/PD0325901.
Per meglio sostenere lo stato di cellule di topo ES nel sistema Vc/PD0325901 cultura,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non divulgare nessun potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da National Foundation Natural Science of China (21435008 e 21327006 di H.W.) e il programma di ricerca di priorità strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB14030200 di H.W.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| fetale siero bovino Australia fonte | Corning | 35-076-CV | Componente del terreno delle cellule ES di topo |
| DMEM/alto glucosio | Hyclone | SH30022 | Componente del terreno delle cellule ES di topo |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Componente del mezzo delle cellule ES di topo |
| non essenziali (NEAA) | Gibco | 11140050 | Componente del terreno |
| piruvato di sodio | Gibco | 11360070 | Componente del terreno a cellule ES di topo |
| L-glutammina | Gibco | 25030081 | streptomicina media a cellule ES di topo |
| , Gibco | 15140122 | Componente del terreno a cellule ES di topo | |
| , PBS | Sigma | P5493 | Cellule di risciacquo |
| tripsina | Hyclone | , SH30042 | Dissociazione cellulare |
| gelatina | Sigma | 48722 | Rivestimento piatti |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | prodotto chimico a piccole molecole per colture cellulari |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | prodotto chimico a piccole molecole per colture cellulari |
| vitamina C | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | XW00508171 | prodotto chimico a piccole molecole per colture cellulari |
| Sistema di purificazione dell'acqua Ultra Bioscience | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Centrifugatore per mezzo di congelamento cellulare |
| Eppendorf | 5427R | per l'estrazione di DNA e proteine | |
| Sigma | P8340 | Componente del tampone | |
| Inibitore della proteasi PMSF | ThermoFisher Scientific | 36978 | Componente del tampone RIPA |
| DTT | Sigma | 43815 | Componente del tampone RIPA |
| EGTA | Sigma | E3889 | Componente del tampone RIPA |
| Kit di purificazione del DNA genomico | Promega | A1125 | Estrazione genomica del DNA |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determinazione della concentrazione di DNA |
| fosfatasi intestinale di vitello | New England Biolabs | M0290 | Digestione del DNA |
| DNasi I | New England Biolabs | M0303 | Digestione del DNA |
| serpente fosfodiesterasi I | Sigma | P4506 | Digestione del DNA |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtrazione del sistema |
| DNA 1290 UHPLC | Agilent | separazione UHPLC | 1290 |
| G6410B | Agilent | G6410B | Analisi MS/MS |
| Colonna Zorbax Eclipse Plus C18 | Agilent | Capsula Zorbax Eclipse Plus | per la separazione UHPLC |
| 5-metilcitosina | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-idrossimetilcitosina (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 anticorpo | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-anticorpo primario |
| Dnmt3a | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-anticorpo |
| primario Dnmt3b anticorpo | abcam ab13604 | Western blot analysis-anticorpo primario | |
| Anticorpo Dnmt3l | abcam | ab3493 | Analisi Western blot-anticorpo |
| primario Anticorpo Dnmt1 | abcam | ab13537 | Analisi Western blot-anticorpo primario |
| β-tubulina | bioworld | BS1482MH | Analisi Western blot-anticorpo primario |
| capra anti-coniglio IgG | abcam | ab6721 | Analisi Western blot-anticorpo secondario |
| capra anti-topo IgG | abcam | ab6789 | Analisi Western blot-anticorpo secondario |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | estrazione dell'RNA |
| Promega | A3500 | Trascrizione inversa dell'RNA | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG kit per la colorazione e il test dell'attività della fosfatasi alcalina | Cellule Biolabs, Inc. | CBA-302 | analisi della colorazione della fosfatasi alcalina |
| cellule ES di topo: WT, 129 SvEv | Fornito dal professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Cina) | ceppo cellulare di cellule ES di topo | |
| microscopio | Zeiss | LSM510 | osservazione delle cellule |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | Analisi statistica | 5.0 |
Riferimenti
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, ....
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Ristampe e permessi
