Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

Sommario

Questo protocollo descrive una tecnica per osservazione di in tempo reale verde fluorescenza Protein (GFP) contrassegnati 4 di trasportatore del glucosio (GLUT4) proteina traffico su stimolazione dell'insulina e la caratterizzazione del ruolo biologico di CCR5 in insulina – GLUT4 via con microscopia di Deconvolution di segnalazione.

Abstract

Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi di salute globale che è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell'insulina. L'ipotalamo nel sistema nervoso centrale (SNC) è il centro di controllo per regolazione segnale risposta dell'insulina e di energia. Infiammazione cronica in tessuti periferici e gli squilibri di alcune chemochine (ad esempio CCL5, TNFα e IL-6) contribuire al diabete e obesità. Tuttavia, i meccanismi funzionali collegamento chemochine e regolamento di segnale ipotalamico insulina ancora rimangono poco chiari.

Modelli di coltura in vitro primaria del neurone sono modelli convenienti e semplici che possono essere utilizzati per studiare il regolamento di segnale dell'insulina in neuroni ipotalamici. In questo studio, abbiamo introdotto esogene GLUT4 proteine coniugate con GFP (GFP-GLUT4) in neuroni ipotalamici primari per tenere traccia di traslocazione di membrana GLUT4 stimolazione dell'insulina. Time-lapse immagini di GFP-GLUT4 traffico della proteina sono state registrate da microscopia di deconvoluzione, che permetteva agli utenti di generare immagini ad alta risoluzione e ad alta velocità senza danneggiare i neuroni significativamente durante l'esperimento. Il contributo di CCR5 in insulina regolato GLUT4 traslocazione è stato osservato in neuroni ipotalamici carenti di CCR5, che è stati isolati e coltivati da topi knockout CCR5. I nostri risultati hanno dimostrato che l'efficienza di traslocazione di membrana GLUT4 è stata ridotta in neuroni ipotalamici carenti CCR5 dopo stimolazione dell'insulina.

Introduzione

Diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è una crisi sanitaria globale. T2DM è caratterizzata dalla segnalazione di danno e infiammazione cronica nei tessuti periferici dell'insulina. L'ipotalamo è il centro di controllo che regola l'omeostasi energetica del corpo, appetito e ritmi circadiani. La cosa più importante, l'ipotalamo media anche la risposta del segnale dell'insulina per regolare il metabolismo sistemico^1,2,3,4,5. Interrompere la segnalazione via potrebbe indurre insulino resistenza^6,7ipotalamico dell'insulina. L'ipotalamo coordina lo stato di energia cellulare e la secrezione di ormoni, come l'insulina e adipochine (ad es., leptina) dai tessuti periferici, per regolare il metabolismo del glucosio sistemico, risposta dell'insulina e l'assunzione di cibo. L'insulina si lega al recettore dell'insulina attiva proteine substrato (IRS) del ricevitore dell'insulina, che quindi attivare molecole dell'insulina di segnalazione a valle, ad esempio PI3K (fosfatidilinositolo 3-chinasi) e AKT (proteina chinasi B (PKB/AKT)), per indurre GLUT4 traslocazione di membrana. I neuroni non sono l'obiettivo principale per l'assorbimento del glucosio in risposta all'insulina; Tuttavia, sono stati identificati livelli significativi di GLUT4 espressione della regione di nucleo arcuato ipotalamico (ARC). Pertanto, il regolamento di GLUT4 in neuroni ipotalamici può svolgere un ruolo importante nella segnalazione nell'asse cervello-periferico dell'insulina.

Molti studi hanno suggerito che l'infiammazione cronica e chemochine infiammatorie nell'ipotalamo anche giocare un ruolo importante nello sviluppo del diabete e dell'obesità, e inibizione dell'infiammazione ipotalamica può invertire la resistenza all'insulina indotta da dieta ^{8 , 9 , 10}. Peraltro, chemochine-CCL5 (ligando di motivo C-C 5, noto anche come RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) e i suoi livelli del recettore CCR5 anche correlare con lo sviluppo di T2DM^11,12. I ruoli di CCL5 e CCR5 nel metabolismo del glucosio e funzione dell'insulina rimangono poco chiari. Uno studio ha riferito che la carenza di CCR5 topi protetti da infiammazione obesità-indotta, del reclutamento del macrofago e insulino resistenza¹¹; al contrario, un altro studio ha riferito che CCR5 carenza altera la tolleranza al glucosio sistemica, come pure degli adipociti e muscolo segnalazione¹²dell'insulina. CCL5 è trovato per aumentare l'assorbimento del glucosio in cellule di T e per ridurre l'assunzione di cibo attraverso la sua azione l'ipotalamo^13,14, tuttavia, sia il meccanismo d'azione e i recettori coinvolti devono ancora essere identificati.

È difficile studiare i meccanismi cellulari alla base dell'effetto di infiammazione del tessuto periferico sull'insulina funzionamento in neuroni ipotalamici. Si tratta di regolamento feedback di circuito del neurone e della eterogeneità cellulare. Per questo motivo, un modello della coltura cellulare in vitro fornisce un modello pulito per studiare gli effetti della chemochina il regolamento segnale ipotalamico dell'insulina. Sebbene esistano che molte affermate linee cellulari immortalizzate di un neurone ipotalamico per uso di ricerca, queste linee cellulari espressi diversi marcatori e rappresentano pertanto, diversi tipi di neuroni ipotalamici¹⁵. Anche se colture primarie ipotalamiche possono essere difficile da mantenere, essi possono fornire la risposta più realistica di neuroni ipotalamici stimolazione dell'insulina e può anche evitare il potenziale effetti sconosciuti che entrano in giocano quando il mantenimento delle cellule a lungo termine nel terreno di coltura con fattori di crescita artificiali.

Nel presente documento, utilizziamo neuroni ipotalamici primari da CCR5 knockout (CCR5^{- / -}) mouse e C57BL/6 wildtype (WT) del mouse e transfect entrambi i tipi di cellule con costruzione GFP-GLUT4. Per studiare il contributo di CCR5 al traffico di membrana GLUT4 insulina mediata, GFP-GLUT4 trasfettati neuroni sono stati trattati con insulina o CCL5 ricombinante. Ci caratterizzano quindi il movimento di GFP-GLUT4 sulla membrana plasmatica in neuroni primari ipotalamici con microscopia di deconvoluzione.

Protocollo

Tutti i protocolli e i metodi utilizzati negli oggetti animali sono stati approvati da istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC) di Taipei Medical University (numeri di protocollo: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)

1. primaria del neurone cultura

1. Preparazione prima di cultura
   1. Rivestire i piatti di cultura con poli-D-lisina (tabella 1) un giorno prima della cultura. Per un piatto 6-pozzetti, aggiungere 1,5 mL poli-D-lisina (0,05 mg/mL) in ciascun pozzetto. Per vivere-imaging, coltura le cellule su un vetrino coprioggetti 12 x 12 mm in una piastra standard di 6 pozzetti rivestito.
   2. Rimuovi/riciclare poli-D-lisina e lavare i piatti due volte con 2 mL ddH₂O.
   3. Preparare gli strumenti chirurgici: un paio di forbici micro-dissezione, forcipe curvo-capovolta e standard con punta dritto forcipe. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e tenerli in etanolo di 75% durante la chirurgia.
   4. Riempire di 10cm di Petri con 20 mL liquido di lavaggio (tabella 1) e tenere il ghiaccio.
   5. Riempire una provetta da 15 mL con 15 mL liquido di lavaggio e tenere il tubo sul ghiaccio.
2. Isolamento del tessuto cerebrale da differenti regioni del cervello
   1. Sacrificio di topi femmina incinta di 16-19 giorno vecchio con protocolli standard euthanization posizionando topi in gabbia non ventilata e poi inebriante con CO₂. E15.5 ~ E16.5 embrioni sono raccomandati per la cultura di un neurone ipotalamico ed E16.5 ~ E17.5 sono più adatti per cultura neuronale ippocampo e corticale.
   2. Sterilizzare la piattaforma, microscopio da dissezione e strumenti di chirurgia con etanolo al 75% per evitare la contaminazione.
   3. Tagliare intorno alla zona del cordone ombelicale (area rossa scura, tratto di linea Figura 1A, 1B ) per isolare i cuccioli facilmente senza danneggiarli (Figura 1, 1D).
   4. Rimuovere la porzione di testa di ogni cucciolo con un paio di forbici (Figura 1E, F), quindi fissare la porzione di testa con il forcipe dritto punta fine per la regione dell'occhio (Figura 1). Uso che un altro punta sottile curvo pinza per rimuovere la pelle esterna e il cranio da due lati e li sbucci fuori dalla zona anteriore alla direzione dorsale (Figura 1 H, nero la freccia indica la direzione). Il cervello dovrebbe essere isolato senza alcun danno (Figura 1I).
      Nota: È essenziale per mantenere l'integrità del cervello per garantire precisione quando isolare diverse regioni del cervello.
   5. Mantenere il cervello isolato in una capsula Petri pulita con terreno ghiacciato lavare per le seguenti operazioni.
   6. Capovolgere il cervello e continuate sul lato ventrale. L'ipotalamo è una struttura circolare al centro del cervello (Figura 1J, freccia punti nella regione ipotalamica). Isolare il tessuto ipotalamico con pinzetta appuntita. Rimuovere le meningi (che hanno un colore giallastro-rosso) con attenzione.
      Attenzione: La rimozione completa dei meninges è un passaggio fondamentale per evitare la contaminazione del fibroblasto.
   7. Tenere il lobo olfattivo con le pinze taglienti e staccare le meningi sottili che circondano l'intero cervello con il forcipe curvo (Figura 1 K, L).
   8. L'ippocampo è una forma di banana che è incorporata nella parte inferiore della corteccia. Capovolgere la parte inferiore della corteccia e separare l'ippocampo dalla corteccia tirandolo verso il lato con il forcipe curvo (Figura 1 MN e O). Assicurarsi di rimuovere tutti i restanti meningi che circondano il tessuto cerebrale.
   9. Quando tutte le regioni del cervello sono state isolate, tritare questi tessuti nei tubi da 15 mL contenente ghiacciata lavaggio medio con l'aiuto delle pinze (punto 1.1.5).
      Nota: I tessuti cerebrali possono essere mantenuti nel mezzo ghiacciato lavare per 2-3 h.
3. Cultura, la placcatura e la digestione del tessuto
   1. Sciacquare i tessuti capovolgendo la provetta di 15ml di tessuto contenenti 2 - 3 volte e poi tenere il tubo dritto per consentire i tessuti di stabilirsi (1-3 min).
   2. Rimuovere il prodotto superiore utilizzando il vetro pipetta Pasteur collegato ad un sistema di vuoto. Per lavare il tessuto, aggiungere 15 mL liquido di lavaggio a freddo di ghiaccio e capovolgere la provetta 2 - 3 volte. Ripetere i passaggi da lavare 3 volte prima del passaggio successivo.
      Attenzione: Essere prudenti dei tessuti sul fondo quando si rimuove il prodotto superiore utilizzando un sistema di vuoto.
   3. Dopo il lavaggio finale, togliere la soluzione di lavaggio con l'aiuto di una pipetta da 1 mL.
   4. Incubare tessuti con buffer di digestione di papaina-tripsina (tabella 1) in bagnomaria a 37 ° C per 7-14 min. agitare le provette ogni due minuti affinché tutti i tessuti sono esposti correttamente nel buffer di digestione.
      Nota: Tempo di incubazione e il volume di tampone di digestione può essere regolate sulla base delle dimensioni del tessuto. Per il tessuto ipotalamico raccolto da 6-8 cuccioli, 300 µ l papaina-tripsina digestione buffer e 7 min tempo di incubazione è raccomandato. Più tessuto richiederà più buffer di digestione.
   5. Neutralizzare l'attività dell'enzima con l'aggiunta di 1 volume di siero bovino fetale. Agitare la provetta 3 - 5 volte a temperatura ambiente.
   6. Tenere il tubo su graticci e attendere 1-2 min consentire i tessuti di stabilirsi; rimuovere il surnatante con cura con una pipetta da 1 mL.
   7. Aggiungere 6 mL placcatura medio (tabella 1) nella provetta e dispensare il tessuto altalenante 50 volte con una pipetta 5ml delicatamente (per raccomanda una piastra a 6 pozzetti, 1,5 mL di terreno di placcatura per pozzetto). Maggior parte delle cellule dissocierà in singole celle dopo ripetuti pipettaggio.
      Nota: Cercate di evitare la formazione di bolle durante lo svolgimento di questo passaggio. Maggior parte dei laboratori utilizzare vetro fiammato pascolo pipette per dissociare il tessuto. Una pipetta da 5 mL con una punta stretta può essere una buona alternativa per questo passaggio.
   8. Tenere un tubo sul rack e attendere 1-2 min consentire i tessuti grosso, ONU-dissociati di stabilirsi. Prendere la fase superiore contenente dissociato cellule ad un nuovo tubo e diluire con placcatura media (5 x volume placcatura mediamente al volume di 1 x di cellule dissociate. Ad esempio, aggiungere 5 mL medium per le cellule dissociate mL 1 di placcatura).
   9. Calcolare la densità delle cellule usando un emocitometro e il numero di cellule di seme nella piastra di coltura rivestita con poli-D-lisina come descritto al punto 1.1.1. Si consiglia di 2-4 x 10⁵ cellule per pozzetto per un piatto di mm 6 ben piatto/35 sono stati raccomandati per gli studi di imaging del neurone. Sarebbe necessaria una maggiore densità per proteina raccolta e l'analisi.
      Nota: Non aggiungere troppo medio di placcatura, 1-1.5 mL di terreno di placcatura in un 6-pozzetti piatto è sufficiente per il fissaggio. Una quantità eccessiva di medie prolungherà il tempo necessario per il collegamento corretto delle cellule.
   10. Attendere 2-3 h e controllare i neuroni seminati sotto il microscopio. I neuroni iniziano a crescere neurite quando attaccano correttamente.
   11. Togliere la soluzione di placcatura e aggiungere 2 mL riscaldato liquido di lavaggio (37 ° C) in un piatto da lavare via il mezzo di placcatura. Ripetere questo passaggio due volte.
   12. Aggiungere 2 mL di coltura completa (tabella 1) in ogni pozzetto nel piatto 6 pozzetti.
   13. Modificare la metà del mezzo ogni 3-4 giorni. Preparare il supporto completo fresco ogni volta. Neuroni coltivati dalle regioni del cervello del mouse differenti avranno diversa morfologia e caratteristiche (Figura 2).

2. transfezione del DNA del plasmide in primaria del neurone con sistema liposoma

Attenzione: Per la transfezione del neurone, un kit di purificazione di DNA privo di endotossina plasmide (Tabella materiali) è consigliato per la preparazione di DNA. Precipitazione dell'etanolo ulteriori può rimuovere il solvente in eccesso e migliora la concentrazione del DNA.

1. Liposoma-basato transfezione del DNA in neuroni primari.
   Nota: Il tempo di transfezione dipende lo stato di maturazione necessario negli esperimenti. I neuroni ipotalamici transfected a DIV 7-10 (giorni in vitroDIV).
   1. DNA: Preparazione della miscela liposoma: diluire GFP-GLUT4 plasmide DNA¹⁶ (2 µ g) in una microcentrifuga provetta contenente 300 µ l del siero basso cultura il mezzo. Preparare un altro tubo del microcentrifuge con 2 liposoma µ l a 300 µ l di siero basso coltura e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare per 20-30 min a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il terreno di coltura del neurone dalla piastra di coltura. Aggiungere la miscela di DNA-liposoma 600 µ l in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 4-6 h.
   4. Dopo 4-6 h, rimuovere la miscela di DNA-liposoma e aggiungere 2 mL terreno di coltura.
   5. Segnali fluorescenti, quali GFP da solo e la proteina GLUT4 coniugato con etichetta GFP (Figura 3 e Figura 4), possono essere osservati dopo 18-72 h.

3. registrazione di immagine live

1. Le cellule che preparare per vivere Imaging
   1. Cultura di WT e CCR5^{- / -} neurone ipotalamico cellule che esprimono la proteina di fluorescenza verde con l'etichetta del trasportatore del glucosio 4 (GFP-GLUT4) #1.5 (o 0,17 mm di spessore) vetrino coprioggetti, che sono stato pre-rivestiti con poli-D-lisina nel passaggio 1.1.1 nel 6-Pozzo piastra.
   2. Rimuovere i coprioggetti con neuroni usando il forcipe con cautela e posizionarlo sulle lastre di vetro con cautela.
   3. Rimuovere medio/liquido in eccesso con salviettine delicato compito. Piegare le salviette due volte e con attenzione li sopra il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente le salviettine senza spostare il vetrino coprioggetti.
      Attenzione: Non premere con forza il coprioggetto contro il vetrino. Lo scopo di questo passaggio è quello di garantire che il vetrino coprioggetto non mossa/drift durante l'acquisizione di immagine causati dalla forza capace di galleggiare.
   4. Posizionare correttamente coprioggetti e diapositive sul tavolino del microscopio di deconvoluzione, con il vetrino coprioggetto rivolto verso il basso e protetto. Questo passaggio è quello di garantire che la posizione di scorrimento rimane costante, così gli utenti possono monitorare lo stesso insieme di cellule bersaglio più tardi.
   5. Osservare WT e CCR5^{- / -} cellule del neurone ipotalamico con una x 60 / 1,42 NA obiettivo obiettivo ad immersione.
   6. Trattare i campioni di cella selezionata con CCL5 (10 ng/mL) o insulina (10 U/mL) per un minimo aggiungere 1,5 µ l di diluito insulina sul bordo del vetrino coprioggetti.
   7. Visualizzare e registrare immediatamente i campioni della cella selezionata. Programma per il software di registrazione video per registrare per 30 min.
2. Deconvoluzione microscopia e analisi
   Nota: Questa parte del protocollo richiede l'uso di un microscopio di deconvoluzione e software specializzato per l'analisi.
   1. Accendere l'alimentazione del sistema di imaging, consentire il tavolino del microscopio inizializzare correttamente e poi accendere la sorgente di luce LED.
   2. Aggiungere olio di immersione (indice di rifrazione 1.520 per campioni di vivere a 37 ° C) su un obiettivo di 60 x 1,42 NA. Porre il vetrino di campione sul microscopio con il coprioggetto rivolto verso l'obiettivo e assicurare la diapositiva in modo corretto.
   3. Utilizzare illuminazione a campo chiaro o fluorescenza per identificare cellule bersaglio. Regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule bersaglio possono essere osservate chiaramente. Non spostare l'obiettivo fuori della zona di coprioggetto per evitare graffi inutili.
   4. Verde di identificare proteine fluorescenza coniugati glucosio Transporter 4 (GFP-GLUT4) il segnale GFP. Identificare le celle di destinazione desiderata per acquisizione di immagini. Posizione della cella di destinazione selezionati possa essere memorizzati per riferimento futuro (Figura 4).
   5. Programma di installazione corretto parametri sperimentali (tra cui il numero di pixel, lunghezza d'onda di eccitazione, percentuale di trasmissione, tempo di esposizione, lo spessore dello stack, intervallo di tempo e tempo totale di imaging) ogni cella di destinazione. Per questo esperimento, il numero di pixel di immagine è stato impostato a 512 x 512 (può essere impostata a 1.024 x 1.024 per una migliore risoluzione) per segnali di GFP. Il tempo di esposizione è stato impostato tra 0,025 a 0,05 s per ogni 5 min minore laterale x, y e z regolazioni può essere controllato dal software consigliati (materiali tavolo).
   6. Impostare il parametro di esposizione per circa 2.000 a 3.000 conteggi a ottenere pixel massima intensità. Per ridurre la fluorescenza photobleaching, ridurre la percentuale di trasmissione della luce di eccitazione per quanto possibile, mentre mantenendo l'esposizione tempo di meno di 1 s. Ripetere questi passaggi per ogni canale aggiuntivo di fluorescenza e ciascuna area di interesse.
   7. Impostare il limite superiore e inferiore dello Z-stack ogni cella di destinazione. Ciò può essere ottenuto spostando il tavolino del microscopio, fino a quando la parte superiore e inferiore della cella di destinazione sono entrambi leggermente fuori fuoco. Gli utenti possono regolare la risoluzione dell'asse z impostando il numero di immagini tra il limite superiore e inferiore (che può essere eseguita impostando la distanza tra ogni immagine).
   8. Pile di immagini sono state deconvoluti e successivamente analizzati con l'aiuto del rispettivo software – velocità da PerkinElmer in questo caso.

Risultati

I neuroni ipotalamici coltivati dai topi sono stati identificati ulteriori immunostaining con proteine associate ai microtubuli ipotalamico specifica proteina - anticorpo pro-opiomelanocortina (POMC) e marker neuronale - 2 (MAP2) (Figura 2A). Abbiamo confermato che il primarie colture di neuroni ipotalamiche espresso proteina ipotalamica POMC. L'espressione del recettore CCR5 e CCL5 in neuroni ipotalamici sono stati identificati con gli anticorpi specifici e co-etichettati con anticorpo POMC (Figura 2A, 2B).

Dopo 3 giorni di coltura, i neuroni sono stati trasfettati con GFP DNA (Figura 3) o GFP coniugato GLUT4 (Figura 4). Espressione di GFP può solitamente essere trovati dappertutto che la cella senza un modello specifico (Figura 3) ma il GLUT4-GFP esprimerà come una struttura punctate nel citosol (Figura 4). Il kit di transfezione utilizzato in questo studio non è il metodo più efficiente per la transfezione del neurone; Tuttavia, è un metodo meno rigoroso per la migliore sopravvivenza delle cellule dopo la trasfezione, che contribuisce a meglio vivere-cella imaging/registrazione più tardi. Le immagini dei neuroni esprimenti GFP-GLUT4 sono stata prelevate prima filmati time-lapse (Figura 4A-B, complementare dei video 1, 2) su stimolazione dell'insulina o stimolazione CCL5 (Figura 4, 3 video supplementari). I segnali di GFP e GFP-GLUT4 sono chiari e forti in neuroni.

Neuroni ipotalamici con transfezione di GLUT4-GFP sono stati ulteriormente trattati con insulina (40 U) per caratterizzare la GFP-GLUT4 traffico. Video rappresentante del movimento di GLUT4-GFP su stimolo dell'insulina in entrambi WT e CCR5^{- / -} neuroni ipotalamici sono indicati come Video 1 e Video 2, rispettivamente.

Figura 1: isolamento dei tessuti provenienti da diverse regioni del cervello del mouse allo stadio embrionale (giorno 16,5). (A-D) I passaggi coinvolti nella separazione dei cuccioli dalla placenta. (E, F) La dissezione di una testa di pup dal corpo. (G-io) I passaggi coinvolti nell'isolamento dell'intero cervello dal cranio. La punta di freccia nera in direzione per essere tirato durante la rimozione del cranio usando il forcipe. (J) l'isolamento dell'ipotalamo. I punti della freccia nera nella regione ipotalamica tra forcipe. (K-L) Isolamento della corteccia del cervello del topo. L'asterisco nero indica la regione corticale del cervello del mouse e la freccia bianca indica la separazione della corteccia dal cervello intero. (M-O) La separazione della parte hippocampal dalla corteccia. La freccia bianca superiore segna il tessuto ippocampale e la freccia bianca inferiore segna il tessuto corticale. Scala bar = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: caratterizzazione del marcatore di un neurone ipotalamico - POMC e la co-espressione di CCL5 e CCR5. Primaria (A) colture di neuroni ipotalamiche sono state etichettate con il segno di un neurone ipotalamico - POMC (rosso), la co-espressione di CCR5 (verde) e il neurone segnapunti MAP2 (grigio). (B) il CCL5 (verde) espressione in neuroni ipotalamici positivi di POMC (rosso) (adattato dai dati supplementari di riferimento¹⁷). Qui, DAPI etichettato il nucleo con il colore blu. Scala bar = 50 µm in (A) e (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: espressione della proteina GFP in neuroni primari mouse. GFP il DNA del plasmide transfected nelle colture primarie di neuroni dopo 4 giorni cultura (DIV4) con liposomi ed espresso per altri 3 giorni (DIV7). (A-B) GFP è espressa in sia neurite e soma. (C-D) Neuroni con finto transfezione; DAPI etichettato il nucleo in (B, D). Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: le istantanee di GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici. (A, C) GFP-GLUT4 proteina espressa nei neuroni ipotalamici Wildtype (WT) e (B) CCR5^{- / -} neuroni ipotalamici. I neuroni sono stati stimolati con insulina (A, B) o CCL5 (C). Le frecce indicano la GFP-GLUT4 punctate nella neurite prima (-) e dopo (+) insulina o CCL5 stimolazione e gli asterischi indicano la superficie GLUT4-GFP prima (-) e dopo (+) CCL5 stimolazione in (C). (Figura adattata da riferimento¹⁷). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5 x Borade Buffer	Azienda	Numero di catalogo	Volume
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768	1,55 g
Borace	Sigma-Aldrich	71997	2,375 g
ddH2O			100 mL
			Filtrata, conservare a 4 ° C
20 x Stock in poli-D-lisina	Azienda	Numero di catalogo	Volume
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407	100 mg
ddH2O			100 mL
			Filtrata, conservare a-20 ° C
1 x poli-D-lisina			Volume
20 x poli-D-lisina			5 mL
5 x Borade Buffer			20 mL
ddH2O			75 mL
Totale			100 mL
			Conservare a 4 ° C
Lavaggio medio	Azienda	Numero di catalogo	Volume
DMEM-alto glucosio	Gibco	12800-017	495 mL
Antibiotico-antimicotica	Gibco	15240-062	5 mL
Totale			500 mL
			Conservare a 4° C
Buffer di digestione di papaina-tripsina:	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione di volume/finale
Papaina (10 mg/mL)	Sigma-Aldrich	P4762	200 µ l (2 mg/mL)
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200-072	200 Μ L (0.05%)
Lavaggio medio			600 Μ l
Totale			1.000 Μ l
			Conservare a-20 ° C
Tecnica di placcatura:	Azienda	Numero di catalogo	Volume
Neurobasal medio	Gibco	21103-049	176 mL
Siero bovino fetale	Gibco	10437-028	20 mL
L-glutammato (200 mM)	Gibco	25030	2 mL
Antibiotico-antimicotica	Gibco	15240-062	2 mL
Totale			200 mL
			Conservare a 4 ° C
Terreno di coltura completa	Azienda	Numero di catalogo	Volume
Neurobasal medio	Gibco	21103-049	95 mL
Supplemento N2 (100x)	Gibco	17502-048	1 mL
Supplemento B27 (50x)	Gibco	17504-04	2 mL
L-glutammato (200 mM)	Gibco	25030	1 mL
Antibiotico-antimicotica	Gibco	15240-062	1 mL
Totale			100 mL
			Preparati al momento

Tabella 1: Digestione buffer e media composizione utilizzata in questo studio.

Video supplementari 1: Insulina stimolata movimento GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici WT. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare dei Video 2: Insulina stimolata movimento GFP-GLUT4 in CCR5^{- / -} neuroni ipotalamici. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare dei Video 3: CCL5 stimolato movimento GFP-GLUT4 in neuroni ipotalamici WT (Video tratto dal riferimento¹⁷). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La possibilità di monitorare le cellule vive, su stimolo CCL5 o insulina, è criticamente importante per studiare l'effetto rapido di CCL5 o insulina sul movimento di GLUT4. Infatti, esso ci permette di visualizzare la differenza significativa tra WT e CCR5^{- / -} neuroni ipotalamici stimolazione dell'insulina. Abbiamo eseguito l'etichettatura superficie della proteina endogena di GLUT4 in WT e CCR5^{- / -} neuroni ipotalamici in diversi momenti dopo stimolazione di insulina¹⁷. L'etichettatura delle proteine della superficie cellulare richiede alta specificità dell'anticorpo con fondo basso. Inoltre, superficie fluorescenza quantificazione anche può essere impegnativo e richiede tempo. Così, registrazione time-lapse consente di essere certi che l'effetto di CCL5 o l'insulina è un vero cambiamento fisiologico basato su condizioni sperimentali, piuttosto che una variazione statistica. Collaborazione con superficie etichettatura di GLUT4 endogeno, offriamo forti prove ed esperimenti per dimostrare come CCL5 e CCR5 partecipare GLUT4 traslocazione e segnalazione dell'insulina.

In studi di biologia molecolare e biologia cellulare moderno, molti esperimenti richiedono l'utilizzo di microscopia di fluorescenza. Questa tecnologia permette agli scienziati di visualizzare le relazioni spaziali tra proteine e/o organelli cellulari, oltre alla direzione del movimento e velocità, gli effetti stimolatori, i cambiamenti morfologici e traffico della proteina. Tuttavia, questa tecnologia ha ancora il suo limite: quando sono eccitati fluorofori, i segnali emessi dalla proteina bersaglio (o zona) possono essere sopraffatti dalla fluorescenza di fondo. Di conseguenza, immagini di fluorescenza possono apparire sfocate con attesi segnali seppelliti profondo in segnali di fondo. Questo fenomeno è particolarmente evidente per l'osservazione delle proteine di membrana-limitano.

Microscopia di fluorescenza nel riflessione totale interna (TIRFM) è stato sviluppato per superare questa difficoltà. Esso permette agli scienziati di visualizzare l'eccitazione di fluorofori associato a superficie selezionata senza intaccare i fluorofori di sfondo. Esso permette agli scienziati di caratterizzare selettivamente caratteristiche ed eventi su una regione di superficie molto sottile come una membrana plasmatica. Microscopia di deconvoluzione è un'immagine richiede un uso intensivo di elaborazione tecnica che è reso possibile con l'aiuto degli avanzamenti tecnologici negli ultimi anni. È stato spesso utilizzato per migliorare la risoluzione dell'immagine digitale di fluorescenza. Come accennato in precedenza, quando fluorofori sono essere eccitati da qualsiasi tipo di illuminazione (come il laser o LED), tutti i fluorophores emetterà segnali luminosi a prescindere se sono a fuoco o no, quindi l'immagine apparirà sempre sfocata. Questa sfocatura è causato da un fenomeno chiamato "Point Spread Function" (PSF), come luce proveniente da una piccola sorgente fluorescente (punto luminoso) sarà sparso ulteriormente e diventano fuori fuoco (sfocatura). In linea di principio, questo evento produrrà un segnale fluorescente a forma di clessidra-come, e un'immagine di fluorescenza può essere costituita da numerosi tali segnali luminosi. Il processo di deconvoluzione può riassegnare tutti i segnali di fluorescenza alla forma originale spot luminoso ed eliminare la maggior parte della luce, out-of-focus per migliorare il contrasto dell'immagine.

Negli ultimi anni, gli algoritmi di deconvoluzione hanno generato immagini con risoluzione paragonabile a quella di un microscopio confocale. Inoltre, in confronto con TIRFM, che impedisce la out-of-focus blur da essere rilevato da una regione limitata di eccitazione, la microscopia grandangolari permette tutta la luce segnala essere rilevato e li riassegna torna alla loro fonte attraverso il processo di deconvoluzione. Quindi, in pratica, deconvoluzione microscopia è diventata non solo un metodo di acquisizione di immagine più efficiente, ma anche un metodo più conveniente rispetto alla microscopia TIRF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio a deconvoluzione DeltaVision	Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)		dotato di obiettivo a immersione in olio 60x/1.42 NA; utilizzato per scattare immagini di cellule vive
Software applicativo SoftWorX	Applied Precision Inc.		utilizzato per controllare il microscopio e la fotocamera
Software VoloCITY	PerkinElmer		utilizzato per analizzare le immagini
Insulin	Actrapid, Danimarca
Liposoma	Invitrogen	11668019	Lipofectamine® 2000, utilizzato per la trasfezione del DNA plasmidico
GFP controllo del DNA del DNA			fornito dal professor Samuel Cushman
DNA plasmidico GFP-GLUT4	fornito dal professor Samuel Cushman
	D Systems	478-MR-025	10ng/ml
Kimwipes	Kimberly-Clark	#FL42572A	0,17 mm spessore
12 mm Coprimicroscopio	Deckglaser	#41001112	utilizzato per lo studio dell'immunizzazione
per micro-dissezione	Klappenecker		Strumento chirurgico
pinza a punta curva	Ideal-tek		Strumento chirurgico
pinza standard a punta dritta	Ideal-tek		Strumento chirurgico
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362	Purify Plasma libero da endotossine DNA
Pipetta da 5 ml	Corning costar	4487	dissociare il tessuto cerebrale