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Articolo metodologico

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

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⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 novembre 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Abstract

Chemiotassi, o la migrazione a una sfumatura di un fattore chemiotattico, è la modalità migliore capita di migrazione diretto. Gli studi utilizzando ameba sociale Dictyostelium discoideum hanno rivelato che una rete di trasduzione del segnale complesso di vie parallele amplifica la risposta di chemioattrattanti e conduce alla polimerizzazione dell'actina prevenuto e sporgenza di un pseudopodo nella direzione di una sfumatura. Al contrario, i meccanismi molecolari guida altri tipi di migrazione diretto, ad esempio, a causa di esposizione a taglio di flusso o campi elettrici, non sono noti. Molti regolatori di chemiotassi esibiscono localizzazione presso il bordo iniziale o in ritardo di una migrazione delle cellule, come pure mostrano cambiamenti transitori in localizzazione o attivazione dopo stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Per comprendere i meccanismi molecolari di altri tipi di migrazione diretto abbiamo sviluppato un metodo che consente l'esame della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta basata sull'esposizione breve (2-5 s) per la tosatura del flusso. Questa stimolazione può essere trasportata in un canale mentre le cellule che esprimono con etichetta fluorescente biosensori per esaminare il comportamento delle singole celle di imaging. Inoltre, la popolazione delle cellule può essere stimolata in un piatto, lisate e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono le versioni attive di proteine di interesse. Combinando entrambi i test, si può esaminare una vasta gamma di molecole attivate dai cambiamenti nella localizzazione subcellulare e/o fosforilazione. Utilizzando questo metodo abbiamo determinato che acuta stimolazione meccanica innesca l'attivazione delle reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale chemiotattico. La capacità di esaminare le risposte cellulari agli stimoli meccanici acuta è importante per comprendere l'origine eventi necessari per motilità indotta da flusso di shear. Questo approccio fornisce anche uno strumento per lo studio della rete di trasduzione del segnale chemiotattico senza l'influenza di confusione del recettore chemoattractant.

Introduzione

Migrazione delle cellule eucariotiche è prevenuto da diversi stimoli chimici e fisici nell'ambiente, compresi gradienti di chemioattrattanti solubile o associata a substrato, rigidità variabile del flusso di shear, campi elettrici o substrati. Anche se ci sono stati molti progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari guida chemiotassi, meno si sa sugli altri tipi di migrazione diretto e come questi segnali diversi sono integrati a livello cellulare per produrre un unificato migratori risposta.

Regia di migrazione verso una crescente concentrazione di un chemoattractant coinvolge tre componenti comportamentali: motilità, rilevamento direzionale e polarità1. Motilità si riferisce al movimento casuale delle cellule raggiunto dalla sporgenza pseudopodo. Rilevamento è la capacità di una cellula per individuare la fonte di un chemoattractant direzionale, che può verificarsi anche in immobilizzato cellule. Polarità si riferisce alla distribuzione asimmetrica più stabile di componenti intracellulari tra il leader e il bordo in ritardo di una cella, che conduce a una maggiore persistenza in movimento.

Risposta cellulare ad un chemoattractant dipende dall'attività delle quattro reti di regolazione concettualmente definiti: recettore / proteina G, trasduzione del segnale, citoscheletro di actina e polarità1. Associazione di fattore chemiotattico per i recettori accoppiati a proteine G trasmette il segnale tramite α proteine G eterotrimeriche e βγ per la rete di trasduzione del segnale a valle, che amplifica il segnale direzionale. Le vie multiple all'interno della rete di trasduzione del segnale agiscono in parallelo e alimentano la rete del citoscheletro di actina per polimerizzazione dell'actina bias e conseguente pseudopodio protrusione, in direzione della sfumatura. Tra importanti regolatori della chemiotassi sono Ras GTPase, TorC2, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), omologo della fosfatasi e tensin (PTEN) e la ciclasi di guanylyl. Meccanismi di feedback all'interno della rete di trasduzione del segnale e tra la trasduzione del segnale e reti di citoscheletro di actina ulteriormente amplificano la risposta. Infine, la rete di polarità mal definiti riceve input dal citoscheletro di actina e ulteriormente biases rete di trasduzione del segnale per promuovere la migrazione persistente nella direzione della sfumatura.

Gran parte della nostra comprensione meccanicistica della chemiotassi è stato reso possibile a causa dello sviluppo di biosensori fluorescente contrassegnati per i vari componenti delle reti di regolamentazione. Molti regolatori di chemiotassi hanno una distribuzione asimmetrica la molecola regolamentazione stessa o la sua attività. Ad esempio, biosensori che riconoscono attivato versioni di piccolo GTPases Ras e Rap1 – Ras-associazione domini di Raf1 (denominato RBD qui) e RalGDS, rispettivamente – localizzare a bordo di una cella di chemotassi2,3. Allo stesso modo, PI3K e suo prodotto fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PIP3), riconosciuto da un dominio di omologia (PH) di pleckstrin, mostrano anche la localizzazione nella parte anteriore di una cella4,5. Al contrario, un 3-fosfatasi PTEN, che converte il PIP3 torna a fosfatidilinositolo (4,5)-bisphosphate, si localizza al bordo della cella6in ritardo. D'importanza, questi biosensori cambiano loro localizzazione in risposta alla stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Marcatori di avanguardia, che sono citosolici o sulle punte delle sporgenze in una cella di riposo, rilocalizzare alla corteccia, considerando che in ritardo di marcatori di bordo, che hanno localizzazione corticale e sono assenti dalle punte delle sporgenze in una cella di riposo, diventano citosolico dopo stimolazione. Analisi della distribuzione di biosensore in risposta alla stimolazione globale con un chemoattractant riduce al minimo il contributo della motilità e della polarità, che spesso confondono le osservazioni. Stimolazione globale o uniforme di una sospensione di cellule con un chemoattractant è utilizzata anche come strumento per valutare i cambiamenti di tutta la popolazione nell'attivazione di proteine, spesso rilevato da proteina fosforilazione7,8,9 . Questa analisi biochimica viene utilizzata principalmente per ottenere informazioni temporali, mentre microscopia viene utilizzata per raccogliere informazioni spaziali e temporali sul comportamento dei vari componenti delle reti di regolamentazione.

Rete di trasduzione del segnale incorpora le caratteristiche di un sistema eccitabile10,11. Le risposte agli stimoli chemiotattici supra-soglia sono "definitiva" e visualizzare i periodi refrattari. Le risposte vengono anche attivate casualmente e possono mostrare comportamento oscillatorio. Eventi di trasduzione del segnale sono localizzati nelle regioni della corteccia che si propagano come onde12,13,14,15. Anteriore, indietro, marcatori sono reclutati per o dissociano da, zone attive delle onde moltiplicazione. A causa della regione refrattaria finali della zona attiva, le onde in modo opposto dirette annichilano come si incontrano. La moltiplicazione delle onde di trasduzione di segnale sottendono le sporgenze cellulari che mediano la cella migrazione10.

Molte delle suddette informazioni su chemiotassi è venuto dagli studi sull'ameba sociale Dictyostelium discoideum, anche se simili meccanismi regolatori sono applicabili anche ai neutrofili e altri tipi di cellule di mammifero16 . Dictyostelium è un organismo modello ben consolidata che ha una robusta risposta chemiotattica durante l'inedia, quando migliaia di singole cellule di migrazione verso un centro di aggregazione, alla fine formano un corpo fruttifero multicellulare contenente spore. La chemiotassi è essenziale anche durante la fase di crescita di singola cellula di questo organismo per l'individuazione di fonti di cibo batterica. D'importanza, la migrazione di singole cellule di Dictyostelium è notevolmente simile alla migrazione di mammiferi neutrofili o cellule tumorali metastatiche, i quali subiscono molto rapida migrazione ameboide-tipo. Infatti, entrambi la topologia globale delle reti regolamentari, così come molte delle vie di trasduzione del segnale individuali coinvolte nella chemiotassi sono conservate tra Dictyostelium e leucociti mammiferi17. Inoltre, altre cellule, come i fibroblasti, utilizzano recettori tirosin chinasici (RTK) invece di GPCR; Tuttavia, RTK può alimentano reti simili.

A differenza di chemiotassi, conoscenza approfondita dei meccanismi di segnalazione che guidano varie altre modalità di migrazione diretto è carente. Analogamente alle cellule la migrazione in una sfumatura di chemoattractant parecchi studi hanno riferito l'attivazione e/o localizzazione di marcatori tipici all'avanguardia, tra cui polimerizzazione dell'actina, PIP3 e/o chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK) 1/2, presso il parte anteriore delle cellule che subiscono diretto migrazione in risposta a taglio di flusso o modifiche in campi elettrici18,19,20,21. Tuttavia, in questi studi l'esposizione allo stimolo ha provocato anche nella migrazione cellulare, lasciando aperta la questione se, ad esempio, i marcatori di avanguardia localizzare specificamente in risposta ad uno stimolo, o se semplicemente si localizza all'avanguardia a causa di aumento del numero di pseudopodi nella parte anteriore di una migrazione delle cellule.

Abbiamo sviluppato le analisi che ci permettono di osservare la risposta delle cellule a perturbazione meccanica acuta inviati come flusso di shear sia a livello di popolazione e come singole celle22. Simile alla stimolazione globale con un chemoattractant, stimoli acutizione con flusso di shear permette lo studio di una risposta cellulare ad uno stimolo meccanico senza il contributo di confondimento da motilità o polarità. Combinando questi saggi biochimici e microscopici con perturbazioni genetiche o farmacologiche permette di imparare a stimoli meccanici come sono percepiti e trasmessi. Inoltre, questo approccio fornisce anche un metodo novello per attingere il sistema a valle del recettore chemoattractant in assenza di un fattore chemiotattico, isolando quindi le reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale dal recettore/G rete di proteina.

Utilizzando le tecniche descritte qui di seguito abbiamo recentemente dimostrato che acuta lo shear stress conduce all'attivazione di più componenti del segnale chemiotattico trasduzione e l'actina citoscheletrica reti22. Applicando lo stimolo meccanico acuto a intervalli variabili, abbiamo dimostrato che, analogamente ai segnalanti, risposta agli stimoli meccanici anche esibisce caratteristiche di un sistema eccitabile, incluso il comportamento definitivo della risposta sotto saturando le condizioni e la presenza di un periodo refrattario. Infine, mediante la combinazione di stimolazione meccanica e chimica abbiamo mostrato che i due stimoli condividano segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti, che probabilmente consentono l'integrazione di molteplici stimoli per migrazione delle cellule di sbieco.

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Protocollo

1. preparazione di soluzioni

  1. preparare HL-5 media utilizzando il seguente: Destrosio 10 g/L, 10 g/L proteose peptone, Estratto di lievito 5 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 0,965 g/L PO 4 e, se non diversamente indicato, la streptomicina 0,03 g/L in acqua deionizzata. Autoclave il mezzo e conservare a temperatura ambiente.
    Nota: A causa delle differenze tra proteose peptone e lievito estratto acquisito dai fornitori differenti, nonché tra i singoli lotti, pH dei media potrebbe essere necessario regolare l'intervallo tipico di 6.4 a 6.7.
  2. Piastre SM preparare utilizzando il seguente: 10 g/L destrosio, peptone 10 g/L, 1 g/L di lievito estratto, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1G/L K 2 HPO 4 e agar 20 g/L in acqua deionizzata. Autoclave, raffreddare e versare 30 mL della soluzione agar a 10 cm di Petri. Una volta che l'agar solidifica, conservare le piastre a 4 ° C per 1 mese.
  3. Preparare 10 x Phosphate Buffer (PB) utilizzando 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O e 6,8 g/L KH 2 PO 4 in acqua deionizzata. Conservare lo stock di 10 x a 4 ° C. Diluire a 1x con acqua demineralizzata per uso.
  4. Preparare Buffer DB completando 1 X PB con MgSO 4 di 2 mM e 0,2 mM CaCl 2.
  5. Preparare 100 millimetri di caffeina in acqua deionizzata. Conservare a − 20 ° C.
  6. Preparare 100 mM campo stock soluzione sciogliendo accampamento sodio sale monoidrato in acqua deionizzata. Preparare un lavoro stock in acqua deionizzata di 1 mM. Conservare entrambe le soluzioni stock a − soluzione accampamento finale del 20 ° C. preparazione alla concentrazione desiderata in DB il giorno dell'esperimento.
    Nota: Soluzioni Stock è possibile congelare-sciolto un paio di volte.
  7. Preparare 25 mM acido folico in 1x PB. Aggiungere poche gocce di 1 N NaOH fino a quando la polvere si scioglie completamente. Conservare a − 20 ° C.
  8. Preparare 3 x campione tampone utilizzando il seguente: 187,5 mM Tris-HCl a pH 6.8, 6% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS), 30% glicerolo, 126 mM dithiothreitol e blu di bromofenolo 0,03% (p/v). Aliquotare e conservare a − 20 ° C.
    1. Prima di utilizzare, scongelare in bagnomaria a 37 ° C e procedere per preparare il tampone con inibitori di proteasi e fosfatasi diluendo 3 x tampone del campione a 1x e aggiungendo 50 mM NaF, 2mm Na 3 VO 4, pirofosfato di sodio di 25 mM e 1 x completa senza EDTA inibitore della proteasi cocktail in acqua deionizzata. Aggiungere gli inibitori immediatamente prima di iniziare la procedura descritta nei passaggi 3.1.2-3.1.3.
  9. Preparare 5 mM Latrunculina A soluzione in DMSO. Aliquotare e conservare a − 20 ° C.

2. Preparazione delle cellule di d. discoideum

Nota: mantenere le cellule d. discoideum HL-5 media sia in piastre di coltura tissutale o in una sospensione di cultura come descritto in precedenza 23. Quando necessario, trasformazione cellule con biosensori fluorescente etichettati secondo protocolli di elettroporazione standard 24. Vari ceppi di d. discoideum, nonché di plasmidi codificanti biosensori o altri geni di interesse possono essere reperite le Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Crescita e raccolta delle cellule Vegetative d. discoideum
    1. per l'analisi di cellule vegetative, crescere le cellule in presenza di batteri per ridurre il numero di macropinosomes, che in genere sono stati osservati in le cellule coltivate axenically 25.
      1. Preparare una cultura della Klebsiella aerogenes inoculando un piccolo numero di cellule da uno stock di glicerolo o da una cultura precedente nel volume desiderato di HL-5 medium senza antibiotici. Incubare la coltura batterica su agitatore orbitale a 200 giri/min (0.42 x g) a temperatura ambiente (20-22 ° C) per 16-18 h.
        Nota: Il K. aerogenes ceppo usato qui è non patogeni (Vedi la Tabella materiali).
    2. Raccogliere d. discoideum nella fase di crescita esponenziale da piastre di coltura del tessuto o da una cultura di sospensione e contare le celle utilizzando un emocitometro secondo produttore ' s istruzioni. Spread 1 x 10 5 d. discoideum celle con sospensione di K. aerogenes 260 µ l su una piastra di SM. Girare la piastra di testa in giù il giorno successivo. Crescere le cellule a temperatura ambiente fino a quando le cellule di d. discoideum iniziano compensazione prato batterico ma prima di iniziare l'aggregazione (~ 36-48 h).
    3. Raccogliere le cellule d. discoideum nel buffer di 5ml DB da loro raschiare con una spatola di vetro. Trasferire le cellule a un tubo in polipropilene da 50 mL. Sciacquare la piastra con un altro buffer 5ml DB e la piscina con la sospensione originale. Riempire il tubo da 50 mL con tampone DB.
    4. Centrifugare la sospensione d. discoideum a 360 x g per 3-4 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 50 mL di Buffer di DB. Ripetere i passaggi di lavaggio fino a quando il surnatante è chiaro (~ 3 o 4 lavaggi). Risospendere il pellet cellulare finale nel buffer DB ad una densità finale di ~ 5 x 10 6 cellule/mL.
  2. Preparazione di aggregazione-cellule competenti d. discoideum
    1. cellule di sviluppare d. discoideum da inedia 1h seguita da 4 h di inedia e una pulsazione con campo di 50 nM ogni 6 min secondo la norma protocolli 23.
    2. a seguito di sviluppo, misurare il volume finale della sospensione cellulare.
    3. Basato sul numero iniziale di celle utilizzate per lo sviluppo, calcolare la densità delle cellule della sospensione finale.
      Nota: Se cAMP è consegnato in volumi di 100 µ l di ogni 6 min, volume cellulare aumenta da 1 mL per ogni ora di accampamento pulsare. Così, per le condizioni standard di utilizzo di 8 x 10 7 cellule in 4 mL di DB, dopo 4 h di sviluppo il volume finale è 7 mL e la densità di cella finale è ~1.1 x 10 7 cellule/mL.

3. Analisi biochimiche della risposta delle cellule a meccanica o stimolazione chimica

cellule
  1. Acuta meccanica stimolazione delle cellule seguita da lisi cellulare
    1. Plate 2 x 10 6 aggregazione-competente (dal punto 2.2) dopo 4 h di sviluppo in piatti di 35mm con 2 mL DB. Permettono alle cellule di fissare per 10 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule due volte con 1 mL DB. Incubare le cellule in DB con 2,5 millimetri di caffeina per 30 min senza alcun disturbo delle piastre.
      Nota: Se le cellule hanno bisogno di essere trattati con un inibitore farmacologico, aggiungere desiderata concentrazione dell'inibitore o lo stesso volume del veicolo appropriato durante basalation con caffeina.
    2. Di applicare lo stimolo meccanico, posizionare la piastra (uno alla volta) su un agitatore orbitale e accenderlo immediatamente a 150 giri/min (0,24 x g) per 5 s.
      Nota: La piastra può anche essere manualmente stimolata dal movimento in maniera trasversali per circa 5 s.
      3. Volte
    3. aspirato buffer indicato dopo l'inizio della stimolazione. Immediatamente lisare le cellule aggiungendo 100 µ l di tampone di campione con inibitori di proteasi e fosfatasi.
    4. Collocare la piastra sul ghiaccio e raccogliere il lisato in una provetta da 1,5 mL. Per ' tempo 0 ', lisare le cellule senza agitazione. Immediatamente dopo la lisi, trasferire i tubi a un blocco di calore di 95 ° C per 10 min. Procedere con immunoblotting o memorizzare lisati a -20 ° C.
  2. Stimolazione delle cellule con un Chemoattractant
    1. Basalate cellule competenti di aggregazione dopo 4 h di sviluppo agitando rapidamente li in presenza di caffeina di 5 mM a 200 giri/min (0.42 x g) su agitatore orbitale per 30 min.
      1. Centrifuga la sospensione cellulare a 360 x g per 3-4 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di Buffer DB ghiacciata. Ripetere la fase di lavaggio.
    2. Risospendere il pellet cellulare finale nel buffer di DB ghiacciata ad una densità finale di 4 x 10 7 cellule/mL sulla base del numero di cellula iniziale utilizzato per sviluppare le cellule (Vedi punto 2.2). Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio prima stimulation.
      1. Pipetta 50 µ l di 10 µM cAMP o veicolo in una tazza di polistirolo disposto su agitatore orbitale.
    3. Per stimolare le cellule, aggiungere 450 µ l di sospensione cellulare ghiacciata nella medesima tazza e attivare immediatamente lo scuotitore a 200 giri/min (0.42 x g). In vari momenti dopo l'inizio della stimolazione (ad es. 10, 30, 45, 60, 120 s), brevemente interrompere lo shaker, estrarre 50 aliquote µ l di sospensione cellulare e lisare le cellule aggiungendoli ai tubi 1,5 mL contenente 25 µ l 3 X tampone del campione.
      1. Per ' tempo 0 ', utilizzare le celle da una sospensione cellulare ghiacciata non stimolate.
        Nota: La temperatura finale della sospensione delle cellule durante la stimolazione è ~ 9 ° C 26. In queste condizioni la risposta di picco si verifica un po' più tardi rispetto al picco osservato per stimolazione eseguita a temperatura ambiente (ad esempio chemoattractant stimolazione delle cellule aderenti sul microscopio, o stimolazione meccanica delle cellule aderenti).
    4. i tubi di trasferimento a un blocco di calore di 95 ° C per 10 min immediatamente dopo la lisi. Procedere con immunoblotting o memorizzare lisati a -20 ° C.
  3. Analisi della risposta delle cellule dall'Immunoblotting
    1. eseguire lisati (da passaggi 3.1.3 o 3.2.4) su un gel di poliacrilammide di Tris-HCl 4-15%, trasferire su una membrana di fluoruro di polivinilidene, blocco e immunoblot con phospho-PKC Ζ Thr410 (per rilevare fosfo-PKBR1 e fosfo-PKBA). Rilevare il segnale tramite incubazione con rafano perossidasi-coniugati anti-coniglio anticorpo secondario, seguita da chemiluminescenza usando il substrato di chemiluminescenza.
    2. Per il rilevamento delle proteine multiple, striscia la macchia con buffer di strippaggio e ri-sonda con un anticorpo primario contro fosfo-p42/44 MAPK Thr302/304 (per rilevare fosfo-ERK2). Confermare la proteina uguale carico macchiando la membrana di fluoruro di polivinilidene con Coomassie Brilliant Blue.

4. Acuta stimolazione meccanica e Live Imaging di singole cellule sul microscopio

  1. valutazione della risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando un dispositivo di flusso
    1. raccogliere e diluire vegetativo o aggregazione-competente cellule a ~ 1 x 10 6 cellule/mL in DB come descritto ai punti 2.1 e 2.2, rispettivamente. ~ 600 µ l di carico nella diapositiva con un canale (vedere la Tabella di materiale per i dettagli). Permettono che le cellule attaccare per 10 min. Assicurarsi che tutte le insenature nella diapositiva sono completamente riempite. Rabboccare con tampone extra se necessario.
      Nota: La diapositiva particolare utilizzata per analisi ha tre ingressi, che alimentano i canali stretti, di 1 mm, ma quindi unire ad un canale di larghezza, 3 mm. L'altezza del canale è di 0,4 mm. Anche se le cellule sono placcate in tutto il canale, solo la porzione ampia è imaged.
    2. Passare una delle linee che è collegato ad un serbatoio di 50 mL attraverso la valvola di destra anteriore dell'unità fluidica (Vedi la Tabella materiali per dettagli). Utilizzando il software per la pompa, assicurarsi che la valvola è chiusa (cioè a sinistra). Riempire il serbatoio con DB.
      1. Impostare la pressione a 50 mbar e accenderlo. Riempire e sciacquare la linea con DB cliccando sulla valvola per aprirlo. Girare la pressione torna a 0 e chiudere la valvola dopo ~ 30 s.
    3. Collegare la linea di una delle tre insenature su un lato della diapositiva senza intrappolare eventuali bolle d'aria. Collegare le altre due insenature. Collegare la linea dallo scarico all'entrata del singolo sul secondo lato della diapositiva.
      Nota: Il tubo utilizzato per le linee di ingresso e scarico in questa configurazione ha un diametro interno di 1,6 mm.
    4. Mettere il vetrino sul microscopio sotto un obiettivo di aria X 20. Per sciacquare il canale, passare la valvola per aprire la riga e fare clic su " pressione ON ", a partire da una pressione più elevata (~ 50 mbar o ~ 40 dyn/cm 2) per spingere il liquido attraverso allo scarico.
      1. Una volta che il liquido esce lo scarico, ridurre la pressione esterna a zero (cioè. gravità flusso solo, ~ 15 dyn/cm 2) e continuare a sciacquare per ~ 30 s. interruttore della valvola nella posizione opposta per fermare il flusso.
    5. Acquisire immagini con illuminazione RFP o GFP su un microscopio a fluorescenza invertito sotto un 40 X obiettivo olio a intervalli di 3 s. Con la valvola in posizione chiusa, accendere la pressione alla pressione desiderata, in genere tra 15 e 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Dopo l'acquisizione di 5 fotogrammi, fornire lo stimolo di commutazione della valvola per il " aprire " posizione. Spegnere il flusso dopo 2-5 s di commutazione della valvola nella direzione opposta.
      Nota: Per alcuni biosensori più debole (ad es. PTEN, CynA e RalGDS) potrebbe essere necessario a celle di immagine utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un 40 X obiettivo olio.
  2. Effetti di Testing di inibitori farmacologici sulla risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando un dispositivo di flusso
    1. piatto di cellule nella diapositiva con un canale come descritto al punto 4.1.1. Impostare due righe: passare una linea attraverso la valvola di destra anteriore come descritto al punto 4.1.2, e la seconda attraverso la parte posteriore sinistra valvola. Bloccare la linea di sinistra e la valvola il " chiuso " posizione (sinistra). Riempire una riga con DB contenente il veicolo appropriato e la seconda con la soluzione contenente un inibitore farmacologico di interesse (ad es. 5 µM Latrunculina A).
      Nota: È necessario bloccare fisicamente la linea di sinistra perché il " chiuso " posizione sinistra apre la valvola per tale riga.
    2. Riempimento e sciacquare il diritto linea attivando la pressione a 50 mbar e la valvola di commutazione il " aprire " posizione (a destra). Commutare la valvola a sinistra dopo circa 30 s. riempimento e sciacquare la linea sinistra rimuovendo il morsetto per ~ 30 s. Connect entrambe le linee a due delle insenature su un lato della diapositiva con un canale, collegare l'ingresso rimanente e collegare lo scarico all'entrata del singolo sul secondo lato. < / l Ho >
    3. lavare il vetrino con il buffer in linea giusta ed eseguire la stimolazione nello stesso buffer come descritto ai punti 4.1.3 e 4.1.4 sopra.
      Nota: Anche se la linea giusta è stato scelto come il primo in questa configurazione, l'ordine potrebbe essere invertito.
    4. Seguito a stimolazione, commutare la valvola per aprire la linea giusta a pressione zero (cioè flusso di gravità solo, ~ 15 dyn/cm 2). Rimuovere il morsetto dalla linea a sinistra e passare la valvola a sinistra per aprire quella linea. Bloccare la prima riga.
    5. Dopo l'esecuzione di 3-5 mL di tampone con inibitore attraverso, passare la valvola a destra per interrompere il flusso e incubare le cellule con l'inibitore per la durata richiesta di tempo (ad es. 15 min). Attivare il flusso di commutazione della valvola ogni ~ 10 min per ~ 15 s per evitare la privazione dell'ossigeno. Ripetere la stimolazione con la seconda riga.
  3. Metodo alternativo per valutare la risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando una micropipetta
    1. impostare la micropipetta riempita con DB secondo protocollo standard 23. Mantenere la pressione di compensazione a 1.500 psi.
    2. Raccogliere e diluire le cellule vegetative come descritto al punto 2.1. Gocce di posto 25 µ l di ~7.5 x 10 5 cellule/mL in una camera a 1-pozzetto, permettono di rispettare per almeno 10 min e coprire con 3ml DB.
    3. Posizionare la camera di un microscopio di fluorescenza invertito equipaggiata con un obiettivo di olio X 40. Individuare le celle. Abbassare delicatamente la micropipetta nel bel mezzo del campo visivo fino a prima toccare il fondo della camera.
      Nota: Poiché la pressione di compensazione è stata fissata a 1.500 Psi, le cellule saranno continuamente esposti ad un flusso molto lento di DB dalla micropipetta.
    4. Iniziare l'acquisizione di immagini con illuminazione RFP o GFP a 3 intervalli di s. Applicare il ' pulite ' funzione per rilasciare un bolo di liquido dalla micropipetta. Continuare io di imagingla presenza di flusso dovuto pressione di compensazione solo n.
  4. Un metodo alternativo per valutare la risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando bulk buffer aggiunta
    1. raccogliere e diluire le cellule vegetative come descritto al punto 2.1. Posto 20 µ l gocce di cellule a ~ 1 x 10 6 cellule/mL in DB al centro un pozzo da un alloggiamento di 8 pozzetti. Consentire alle cellule di aderire per almeno 10 min.
    2. Iniziare l'acquisizione di immagini con illuminazione RFP - o GFP-specifico su un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x a 3 intervalli di s. Concentrarsi su un'area vicino al bordo della goccia.
    3. Rapidamente µ l 430 di DB su un lato del pozzo. Continuare la formazione immagine.
    4. Per l'analisi dell'interazione tra stimoli meccanici e chimici, 12 o 45 s segue lo stimolo meccanico, delicatamente aggiungere 50 µ l di acido folico (concentrazione finale 20 nM) o veicolo (DB) senza indurre una risposta meccanica. Continuare la formazione immagine.
  5. Quantificazione della risposta
    1. aprire il file TIFF a 32-bit del software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali particolari) 27.
    2. Sotto il ' Analyze ' scheda, vanno a " impostare misure ". Selezionare la casella per ' dire valore grigio '. Assicurarsi che le altre caselle non vengono controllate. Fare clic su " OK ".
    3. Sotto la ' processo ', fare clic " sottrarre sfondo ". Mantenere il raggio di rotolamento sfere a 50 pixel e fare non controllo le opzioni elencate nel menu. Zoomare su una cella utilizzando il ' lente di ingrandimento ' strumento.
    4. Usando il ' rettangolo ' strumento, disegnare una casella (~2.5 x 2,5 µm 2) nel citosol, assicurandosi che non disegnare sopra il nucleo o la membrana plasmatica. Premere " Ctrl " + " M " tasti o andare alla ' Analyze ' scheda e fare clic su " misura " per determinare il valore di grigio medio della scatola. Anticipo per i fotogrammi successivi e misura ancora una volta, assicurandosi che la casella rimane nel citosol.
      Nota: Poiché le cellule d. discoideum si muovono molto rapidamente la casella può essere spostata da un fotogramma a quello successivo di tenerlo nel citosol.
    5. Dopo tutto dei telai sono state analizzate, copiare i valori in un foglio di calcolo. Per tenere conto cellula--cellula variazione nei livelli di espressione di diversi biosensori, normalizzare i valori per il valore di grigio medio osservato al tempo 0. Calcolare il reciproco dei valori in modo da riflettere l'accumulo del segnale sulla corteccia.

5. Continuo stimolo meccanico e Live Imaging di singole cellule sul microscopio

  1. impostare le celle esattamente come descritto sopra per l'analisi di stimolazione meccanica acuta nei passaggi 4.1.1 - 4.1.3. Aprire il tappo che copre il serbatoio con il buffer, quindi il volume può essere superato se la risposta è analizzato per più di pochi minuti alla volta.
    Nota: Poiché il serbatoio rimane aperto per tutta la durata dell'esperimento, questa analisi è condotta in assenza di pressione esterna e si basa sul flusso di gravità da solo. Per aumentare il tasso di flusso per gravità, lo scarico può essere collocato su un tavolo sotto il microscopio.
  2. Iniziare le cellule con illuminazione RFP - o GFP-specifico su un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x a 3 intervalli di s per l'analisi delle risposte di biosensore di imaging. In alternativa, l'immagine con contrasto di fase utilizzando un obiettivo X 20 a intervalli di 10 s per l'analisi di migrazione globale cellulare.
  3. Accendere il flusso dopo diversi frame con l'impostazione di pressione zero (ovvero flusso è dovuto gravità da solo o ~ 15 dyn/cm 2) commutando la valvola nella posizione di apertura. Quando il livello del liquido scende a 5-10 mL nel serbatoio, rabboccare con buffer di più. Assicurarsi di aggiungere il liquido attentamente così bolle d'aria non rimanere intrappolate nelle linee.
    Nota: È importante aggiungere liquido alla stessa temperatura per evitare una risposta allo shock nelle cellule.
  4. Quantificare la velocità di cella e persistenza utilizzando software di analisi di migrazione (Vedi la Tabella materiali particolari) secondo produttore ' istruzioni s.

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Risultati

Risposta temporale dei regolatori di chemiotassi alla stimolazione meccanica acuta

Per valutare la risposta delle cellule di d. discoideum a stimolo meccanico, le cellule aderenti di aggregazione-competenti sono stati esposti a un breve impulso di flusso di shear. Aggregazione-competenti D. discoideum cellule secernono cAMP, che può essere percepita dai cellule vicine. Per superare il contributo di segnalazione de...

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Discussione

I metodi descritti qui offrono un modo pratico per valutare la popolazione e comportamento delle singole celle in risposta a di taglio di flusso. D'importanza, mentre gli studi precedenti analizzati localizzazione dei principali e in ritardo di marcatori di bordo durante la migrazione, l'attuale approccio permette di indagine degli effetti immediati applicando il flusso di shear acutamente. Usando questo metodo abbiamo dimostrato che, in realtà, la risposta iniziale delle cellule per la tosatura del flusso non richiede m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute R35 GM118177 a PND.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
DestrosioFisherD16-1Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)
Proteoso peptoneFisherDF0120-17-6Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)
Estratto di lievitoFisher50-550-445Utilizzare per preparare terreni HL-5 e piastre SM (passaggi 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Utilizzare per preparare terreni HL-5 e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Utilizzare per preparare terreni HL-5, piastre SM e tampone fosfato 10X (passaggi 1.1-1.3)
Streptomicina (diidrostreptomicina solfato)FisherICN10040525Utilizzare per preparare terreni HL-5 (passaggio 1.1)
Peptone (Bacto)FisherDF0118-17-0Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)
AgarFisherBP1423-500Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)
MgSO4FisherM65-500Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)
CaCl2FisherC79-500Utilizzare per preparare DB Buffer (passaggio 1.4)
CaffeinaFisherO1728-500Utilizzare per preparare caffeina (passaggio 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosina 3 ft.,5 ft.-monofosfato ciclico, sale di sodio)Fisher11-680-1100MGUtilizzare per preparare cAMP (passaggio 1.6)
Acido folicoSigmaF7876Utilizzare per preparare il folico acido (fase 1.7)
Tris baseFisherBP152-500Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)
Dodecil solfato di sodio (SDS)FisherBP166-500Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)
GliceroloFisherG33-500Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)
Ditiotreitolo (DTT)Bio-Rad1610610Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (passaggio 1.8)
Blu di bromofenoloBio-Rad1610404Utilizzare per preparare un tampone campione 3X (fase 1.8)
NaFFisherS299-100Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Utilizzare per preparare una tampone per campioni con inibitori della proteasi e della fosfatasi (fase 1.8)
Pirofosfato di sodio decaidratoFisherS390-500Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)
Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA (Roche)Sigma11873580001Utilizzare per preparare il tampone del campione con inibitori della proteasi e della fosfatasi (passaggio 1.8)
Latrunculina AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Utilizzare per preparare la latruncolina A (passaggio 1.9)
4-15% Tris-HCl poliacrilammideBio-Rad3450029Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)
Membrana in fluoruro di polivinilideneBio-Rad1620177Utilizzare per l'immunoblotting (fase 3.3)
Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorpo di coniglioSegnalazione cellulare2060Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (fase 3.3)
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorpo XPCell Signaling4370Anticorpo primario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)
Coniglio IgG HRP Linked Whole Ab (da Donkey)GE HealthcareNA934-100ULAnticorpo secondario per l'uso nell'immunoblotting (passaggio 3.3)
Substrato di chemiluminescenza potenziato (Clarity Western ECL Substrate)Bio-RadUtilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)
Tampone di strippaggio (Restore Plus Western blot stripping buffer)PiercePI46430Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Utilizzare per l'immunoblotting (passaggio 3.3)
Ceppo K. aerogenes (non patogeno)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NameCompanyNumero di catalogoComments
Materiali e attrezzature
Agitatore orbitale (modello G-33 o un'alternativa comparabile)New Brunswick ScientificUtilizzare per coltivare K. aerogenes (passaggio 2.1.1) e per basare e stimolare le cellule D. discoideum (passaggio 3). Il raggio di rotazione di questo agitatore è di 9,5 mm.
Piastra di Petri da 10 cmFisherFB0875712Utilizzare per preparare piastre SM (passaggio 1.2)
EmocitometroFisher02-671-51BUtilizzare per contare le cellule D. discoideum (passaggio 2.1.2)Piastra
35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)Fisher08-772AUtilizzare per piastrareD. discoideumcell per la stimolazione meccanica seguita da lisi cellulare (passaggio 3.1.1)
Coppetta in polistirene (5 mL)VWR13915-985Utilizzare per stimolare la sospensione cellulare D. discoideum con un chemioattrattivo (passaggio 3.2.2)
Unità fluidica con pompa (ibidi Pump System)Ibidi10902Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)
Vetrino con un canale (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: vetrino coprioggetti in polimero #1.5, coltura tissutale trattata, sterilizzato)Ibidi80316Utilizzare per piastre D. discoideum cellule per la stimolazione meccanica erogata da un dispositivo fluidico (passaggi 4.1, 4.2 e 5)
Serbatoi da 50 mL (supporto del serbatoio Ibidi per unità fluidica)Ibidi10978Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5)
Linee per l'unità fluidica (Set di perfusione GIALLO e VERDE)Ibidi10964Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5). Nota: le due linee possono essere tagliate anche dal tubo da 1,6 mm (numero di catalogo 10842).
Linea per lo scarico (tubo con diametro interno di 1,6 mm)Ibidi10842Utilizzare per configurare il dispositivo fluidico per l'erogazione della stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum in un canale (passaggi 4.1, 4.2 e 5).
Microscopio invertito Zeiss Observer.Z1 dotato di un obiettivo ad olio 40X/1.3 e di un obiettivo ad aria 20X/0.3 (o un'alternativa comparabile)ZeissUtilizzato per l'imaging di cellule D. discoideum con illuminazione a contrasto di fase o a fluorescenza (passaggi 4 e 5)
Microscopio confocale a disco rotante UltraView dotato di un sensore a 40&/1.25... Obiettivo dell'olio 0,75 (o un'alternativa comparabile)Perkin-ElmerDM 16000Un'alternativa utilizzata per l'imaging di cellule D. discoideum (passaggio 4.1.4)
Microiniettore FemtoJet (Eppendorf; modello 5247 o un'alternativa comparabile) con Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D e 5192000027Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3). Nota: i numeri di catalogo si riferiscono alla versione più recente dell'apparecchiatura (4i).
Micropipetta (Femtotip; 1 μ m diametro esterno, 0,5 μ m diametro interno )Eppendorf930000035Utilizzare per erogare la stimolazione meccanica alle cellule D. discoideum mediante una micropipetta (passaggio 4.3)
Puntali per microloader (Eppendorf Femtotips Microloader Tips per microiniettore Femtojet)Eppendorf5242956.003Utilizzare per riempire la micropipetta (femtopunta) con tampone (passaggio 4.3.1)
Camera a 1 pozzetto (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per la stimolazione meccanica erogata da una micropipetta (passaggio 4.3.2)
Camera a 8 pozzetti (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)Fisher12-565-338Utilizzare per la piastra di cellule D. discoideum per stimolazione meccanica erogata mediante aggiunta di tampone di massa (passaggio 4.4.1)
NameAziendaNumero di catalogoComments
Software
Software di analisi delle immagini (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Utilizzare per quantificare la risposta alla stimolazione meccanica (passaggio 4.5)
Software di analisi della migrazione (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Utilizzare per quantificare la velocità e la persistenza delle celle (passaggio 5.4)
gel 1705060 da

Riferimenti

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