Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni

Summary

Questo protocollo descrive la completa decellularizzazione di miocardio umano pur conservando le sue componenti della matrice extracellulare. Ulteriore elaborazione dei risultati nella produzione di microparticelle e un idrogel autoassemblanti cytoprotective matrice extracellulare.

Abstract

Matrice extracellulare acellulare preparazioni sono utili nello studio delle interazioni cellula-matrice e agevolare le domande di terapia rigenerativa delle cellule. Diversi prodotti commerciali di matrice extracellulare sono disponibili come idrogel o membrane, ma questi non possiedono attività biologica tessuto-specifica. Perché decellularizzazione di aspersione non è solitamente possibile con tessuto cardiaco umano, abbiamo sviluppato un processo di decellularizzazione immersione 3-passo. Fette del miocardio umani procurati durante la chirurgia vengono prima trattati con buffer di lisi di hyperosmolar privo di detergente, seguita da incubazione con il solfato dodecilico di sodio di detersivo, ionico, e il processo è completato, sfruttando l'attività intrinseca della dnasi di siero bovino fetale. Questa tecnica si traduce in fogli senza cellula di matrice extracellulare cardiaca con in gran parte conservata composizione architettura e biopolimero di tessuto fibroso, che sono stati indicati per fornire stimoli ambientali specifici per le popolazioni delle cellule cardiache e staminali pluripotenti indotte cellule. Matrice extracellulare cardiaco possono quindi essere ulteriormente trasformati in una polvere di microparticelle senza ulteriore modificazione chimica, o, attraverso la digestione pepsina a breve termine, in un auto-assemblanti idrogel di matrice extracellulare cardiaca con conservato bioattività.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) fornisce non solo il supporto strutturale, ma è importante anche per cellula biologica e tessuto funzione¹. Nel cuore, l'ECM interviene nella regolazione delle risposte patofisiologiche come fibrosi, infiammazione, l'angiogenesi, la funzione contrattile del cardiomyocyte e attuabilità e destino delle cellule staminali e progenitori residenti. Oltre ai suoi componenti primari - fibrosi glicoproteine, glicosaminoglicani e proteoglicani - contiene una serie di fattori di crescita secreti, citochine e membranose vescicole contenenti acidi nucleici e proteine^2,3.

Recentemente è diventato chiaro che acellulare preparazioni di ECM non sono solo inestimabile per lo studio delle interazioni cellula-matrice, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche basate sulle cellule. L'importanza di fornire un ambiente adeguato per prodotti terapeutici delle cellule o tessuti ingegnerizzati è ormai ampiamente riconosciuta. Tentativi sono stati fatti per combinare sospensioni cellulari o composti attivi definiti idrogeli biopolymeric^4,5,6 o con cocktail di proteina secreta dalle cellule di sarcoma murino (cioè, Matrigel, Geltrex) ⁷. Tuttavia, l'ex hanno limitato la bioattività, quest'ultimo è problematico nei processi di GMP-grado ed entrambi mancano la bioattività di tessuto-specifica di cardiaco ECM (cECM)^{8,9,10, 11,12,13}.

Decellularizzazione del miocardio è stata eseguita in precedenza da aspersione di tutto il cuore tramite le vene coronarie^14,15. Mentre questo è possibile nei cuori degli animali, cuori umani intatti sono raramente disponibili. Di conseguenza, è stato favorito un processo di immersione che permette una gestione di campioni di tessuto ottenuti in sala operatoria. Il nostro protocollo "3-step" contiene 3 separato incubazione passi cioè Lisi, solubilizzazione e rimozione del DNA. Produce del miocardio umano ECM con^16,in gran parte conservata della proteina e glicosaminoglicani composizione¹⁷. Queste fette cECM permettono per studi in vitro delle interazioni cellula-matrice, ma sono poco adatte per le potenziali applicazioni terapeutiche su scala umana. Il processo di fabbricazione è stato poi esteso per produrre microparticelle cECM liofilizzato o un cECM idrogel¹⁸.

Questo protocollo consente il decellularizzazione di miocardio umano ottenuto da campioni chirurgici, preservando i componenti principali del miocardio della matrice extracellulare (ECM) e la loro attività biologica. Questo protocollo è consigliato quando cardiaco umano ECM con conservato bioattività di tessuto-specifici è necessario per gli studi sperimentali delle interazioni cellula-matrice, o quando è necessario un ambiente adatto per gli approcci basati su cellule di rigenerazione miocardica. In linea di principio, è anche possibile adattare questo protocollo alle condizioni GMP-grado, così che l'uso di elaborati cECM dovrebbe essere fattibile applicazioni terapeutiche in futuro.

Protocol

Il protocollo di studio è conforme ai principi etici delineati nella dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato del Consiglio e l'etica di revisione istituzionale della Charité Medical University. Tutti i pazienti di cui scritto, il consenso informato per l'uso del tessuto del cuore per studi sperimentali.

1. preparazione del miocardio umano per il sezionamento

1. Ottenere il miocardio ventricolare di sinistra (la dimensione varia a seconda del tipo di intervento chirurgico) direttamente dalla sala operatoria e trasporto in PBS freddo in un recipiente sterile.
2. Rimuovere tutto il tessuto grasso con un bisturi sterile con una lama n. 10 in condizioni sterili.
3. Tagliare il miocardio in cubetti di circa 1 x 1 x 1 cm usando un bisturi.
4. Posizionare i cubi nelle provette sterili da 50 mL.
   Nota: Per mettere in pausa, eseguire passo 1.5, altrimenti passare al punto 2.2. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento per impedire la degradazione proteica e una diminuzione nella qualità del tessuto.
5. Conservare le provette contenenti i cubi a-80 ° C. Il tessuto può essere conservato per diversi mesi.

2. taglio dei cubi miocardio a fette

1. Prendere le provette contenenti i cubi preparati fuori dal freezer.
2. Trasporto su ghiaccio al criostato.
3. Impostare la temperatura dell'oggetto e camera a-15 ° C.
   Nota: La temperatura giusta è fondamentale per garantire perfetta di sezionamento.
4. Provette da 50 mL freddo vuoto e timbri in aula o il ghiaccio secco.
5. Aggiungere uno strato (circa 0,5 - 1,0 mL) di donatrici medio sul timbro freddo e lasciate che si congelare fino a quando è bianco e solido.
6. Aggiungere un secondo strato di mezzo di donatrici e inserire un cubo di miocardio su questo strato.
7. Assicurarsi che il mezzo di donatrici e miocardio sono completamente congelato prima di continuare.
   Nota: Quando il mezzo campione e donatrici non sono congelati il sezionamento sarà compromessa. Donatrici completamente congelati medio si trasforma da liquido e trasparente solido, bianco e non trasparente. I cubi del miocardio bisogno almeno 30 min fino a 1 h di congelare completamente se continuando direttamente dal punto 1.4. Quando il tessuto viene congelato non dovrebbero deformare quando toccato/gestito con le pinzette.
8. Inserire il timbro con il miocardio congelato nel supporto e serrare tutte le viti.
9. Tagliare la superficie del tessuto fino ad ottenuta una superficie anche sezionamento.
10. Impostare lo spessore di 300 µm di sezionamento.
11. Sezione del miocardio congelato con sezionamento automatico. Questo garantisce sezioni di taglio uniforme. Circa 30-40 sezioni possono essere affettati da un cubo.
12. Mettete ogni fetta dopo il sezionamento senza bloccare in un tubo da 50ml preraffreddato.
    Nota: Non premere saldamente le fette o pack. Circa 40 fette possono andare bene in una provetta.
13. Chiudere le provette riempite e metterli su ghiaccio.
    Nota: Per mettere in pausa vai su con passo 2.14, altrimenti continuare con il passaggio 3.2.
14. Archivio miocardio fette a-80 ° C. Le fette possono essere conservate per diversi mesi.

3. decellularizzazione di miocardio umano fette

1. Prendere il numero necessario di provette da 50 mL contenente sezioni di miocardio fuori dal congelatore a-80 ° C e il trasporto sul ghiaccio.
2. Trasferire le sezioni congelate di tutte le provette da 50 mL dal punto 3.1 in un becher sterile. Circa 40 fette vengono aggiunti il becher per tubo da 50 mL. Il bicchiere deve essere tre volte il volume dei tubi 50 mL; ad esempio, per decellularizzazione di un tubo da 50 mL utilizzare un becher da 150 mL.
3. Aggiungere 50 mL di soluzione lisi (10 mM Tris, 0.1% w/v EDTA, pH 7.4 in H₂O) al tubo da 50 mL con le fette del miocardio.
4. Agitare le fette del miocardio in un becher sterile a 100-150 giri continuamente per 2 h a temperatura ambiente.
5. Filtrare il liquido con le fette di tessuto attraverso un colino grossolano. Trasferire le fettine di tessuto con una pinzetta smussata in un recipiente sterile di nuovo. Aggiungere 50 mL di SDS di 0,5% in PBS per tubo 50ml iniziale delle fette di miocardio (ad es., uso 100 mL SDS soluzione quando due provette da 50 mL di sezioni del miocardio sono essere decellularized).
6. Agitare continuamente per 6 h a 100-150 giri/min a temperatura ambiente.
7. Filtrare il liquido con le fette di tessuto attraverso un colino grossolano. Trasferire le fettine di tessuto con una pinzetta smussata in un nuovo recipiente sterile e lavare 3 volte con 50 mL di PBS per 10 minuti ciascuno, mentre si stringono a 150 giri/min. Successivamente, lavare una notte in PBS con 1% di penicillina/streptomicina e l'1% nistatina (PBS-P/S-N) a 100-150 giri/min e 4 ° C agitando.
   Nota: Lavaggio accurato è fondamentale per rimuovere completamente qualsiasi residuo SDS. Residuo di SDS è tossici quando l'ECM è usato in combinazione con le cellule.
8. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 25 mL preriscaldato FBS (37 ° C) con 1% di penicillina/streptomicina e l'1% nistatina le fette decellularizzate per tubo da 50 mL iniziale delle fette del miocardio.
9. Incubare per 3 ore a 37 ° C. In questo passaggio, qualsiasi DNA rimanente viene rimosso dalla matrice a causa della intrinseca attività dnasi degli FB.
10. Trasferire le fettine in un recipiente sterile nuovo e lavare 3 volte con 50 mL di PBS per 10 minuti ciascuno, mentre si stringono a 150 giri/min.
    Nota: Le fette di ECM possono essere memorizzate in PBS-P/S-N a 4 ° C per diversi giorni. Tuttavia, si consiglia di procedere immediatamente.

4. elaborazione del cECM Decellularized in polvere

1. Sistemare le fettine di ECM senza bloccare in una nuova piastra 6 pozzetti sterile. Congelare il ECM a-80 ° C e lyophilize per 2 giorni in un liofilizzatori.
   Nota: più di una fetta può essere posizionata per pozzetto. Disporre le fette in modo da coprire completamente la superficie del pozzo. Sovrapponendo le fette non influisce il successo di polverizzazione successive.
2. Per la polverizzazione della fetta ECM, uso specifico fresatura tubi contenenti perline di ceramica 1,4 mm (Vedi Tabella materiali). Riempire le provette senza bloccare con ECM liofilizzato con una pinzetta smussata sterile. Per risultati ottimali, si raccomanda un peso totale di ECM tra 10-20 mg.
   Nota: Se l'ECM è troppo compattamente nei tubi fresatura il processo di polverizzazione sarà influenzato negativamente.
3. Snap-congelare i tubi in azoto liquido.
   ATTENZIONE: azoto liquido è estremamente bassa temperatura, usura di protezione personale appropriate.
4. Inserire i tubi congelati la fresatrice e polverizzare l'ECM.
   1. Impostare una durata di 30 s e un massimo di velocità e avviare il dispositivo.
   2. Dopo aver terminato, estrarre i tubi e snap-congelare nuovamente in azoto liquido.
   3. Ripetere cinque volte.
5. Lavare le microparticelle dai tubi aggiungendo 1 mL ddH₂O al tubo e agitare o vortice per solubilizzare completa. Filtrare la soluzione eterogenea attraverso una maglia di 200 µm in una provetta da 50 mL.
6. Congelare il tubo a-80 ° C o azoto liquido.
7. Sostituire il coperchio standard del tubo con un filtro da 0,22 µm. Questo coperchio filtro impedisce alla polvere di fluire fuori dal tubo ma permette la circolazione dell'aria per evaporazione dell'acqua.
8. Inserire le provette nei liofilizzatori e lyophilize nuovamente per rimuovere l'acqua dal passaggio (punto 4.5)
   Nota: Liofilizzazione in questa fase può richiedere fino a 3 giorni.
9. Conservare la polvere a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione o continuare con il passaggio 5.1.

5. enzima base omogeneizzazione di cECM Micro-particelle

1. Sciogliere la pepsina suina in 0,01 M HCl (pH 2.0) ad una concentrazione di 1 mg/mL. Posizionare su un agitatore rotante a temperatura ambiente finché non è completamente dissolto.
2. Sciogliere la polvere liofilizzata di ECM umana (passo 4,8) della soluzione di pepsina a una concentrazione finale di 10 mg/mL. Mescolare accuratamente attraverso il pipettaggio. Il volume totale dipende dalla quantità di soluzione di ECM necessaria. Ad esempio, sciogliere 10 mg di polvere di ECM in 1 mL di soluzione di pepsina.
   Nota: Particelle di dissoluzione può essere supportato tramite delicato nel Vortex (1.000-1.500 giri/min). Restanti grumi di microparticelle influenzerà negativamente la digestione.
3. Trasferire la soluzione in provette da 2 mL con un volume di 1 mL per tubo.
4. Mettere i tubi in uno shaker di tubo per 48 h a 27 ° C e a 1.200 giri/min.
5. Prendete i tubi fuori lo shaker e posto su ghiaccio o un supporto del tubo pre-raffreddata.
6. Mix 1/9 del volume della soluzione ECM di freddo 10X PBS (pH 7,4) con 1/10 del volume della soluzione ECM di freddo 0,1 M NaOH in un tubo preraffreddato e posto sul ghiaccio. Questa miscela sarà neutralizzare la soluzione ECM digerita e inattivare irreversibilmente la pepsina.
7. Aggiungere la soluzione di ECM per la miscela di neutralizzazione e mescolare accuratamente attraverso il pipettaggio o tramite vortex.
8. Impostare l'ECM fino alla concentrazione desiderata con 1x PBS (pH 7.4). Il pH della soluzione può essere controllato con carta pH.
   Nota: Esempio di calcolo per 10ml digerito soluzione ECM:
   Aggiungere 10 mL di HCl (pH 2.0) pepsina suina 10mg.
   Aggiungere 100 mg ECM polvere soluzione di pepsina.
   Nota: Esempio di calcolo per neutralizzare 10ml digerito soluzione ECM e impostando la concentrazione di 8 mg/mL:
   Vol_finale = c_avviare x Vol_avviare / c_finale = 10 mg / mL x 10ml / 8 mg/mL = 12.5 mL
   Vol_10xPBS = Vol_avviare / 9 = 1/9 da 10 mL = 1,11 mL 10X PBS
   Vol_NaOH = Vol_avviare / 10 = 1/10 da 10 mL = 1 mL
   Vol_1xPBS = Vol Vol_finale - Vol_avviare -_10xPBS - Vol_NaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL

Results

Il protocollo di 3 fasi per decellularizzazione di miocardio umano ha presentato qui risultati in quasi completa rimozione del materiale cellulare, mantenendo i componenti chiave di ECM e la struttura fibrillare del ECM. Dopo decellularizzazione, la rimozione lorda delle cellule dal tessuto è evidente il cambiamento di colore (Figura 1A). L'analisi istologica con macchie di H & E e Masson Trichrome ha rivelato l'assenza completa di cellule intatte residua...

Discussion

Durante la preparazione del miocardio umano ECM, l'obiettivo è quello di conseguire i seguenti obiettivi: rimozione di materiale cellulare immunogeno pertinente, conservazione dell'integrità di ECM e bioattività, sterilità, non-tossicità del prodotto finale, compatibilità GMP-processo, e idoneità del prodotto per una determinata applicazione in termini di gestione. Combinando il nostro protocollo di decellularizzazione 3-passaggio con ulteriore trasformazione in microparticelle o idrogel autoassemblanti, materiale ECM ca...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance	DR Precisa, Dietikon, Svizzera	Precisa XR 205SM
Lame Nr.10 Skalpell Nr.3	InstrumenteNRW, Erftstadt, Germania	SK-10-004
Piastre per colture cellulari (6 pozzetti)	Greiner, Frickenhausen, Germania	657160
Criostato CM	Leica, Wetzlar, Germania	3050S
EDTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	8043.3
Provette di reazione Eppendorf (1,5 o 2 ml)	Greiner, Frickenhausen, Germania	616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml	Greiner, Frickenhausen, Germania	188271, 227270
Siero fetale bovino (FBS)	Biochrome, Berlino, Germania	S 0115
Sistema di liofilizzazione	Labconco, Kansas City, USA	7670520
Congelatore (-80° C)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Forma 900 Series
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	281.1
Lame per microtomo Tipo 819	Leica, Wetzlar, Germania	14035838925
Omogeneizzatore Minilys	PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germania	91-PCSM
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	K021.1
Nystatin	PAN Biotech, Aidenbach, Germania	P06-07800
PBS	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	14190-094
Penicillina/streptomicina	Life Technologies, Darmstadt, Germania	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania	P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1,4 mm	Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germania	91-PCS-CK14
Rotamax 120 Agitatore per piastre	Heidolph, Schwabach, Germania	544-41200-00
SDS	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	CN30.3
Stereomicroscopio	Leica, Wetzlar, Germania	M125
Steriflip-GP, 0,22 &; m	Merck Millipore, Darmstadt, Germania	SCGP00525
Miscelatori analogici a bilanciere e a rulli Stuart	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania	Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound	Hartenstein, Würzburg, Germania	TTEK
Set per trasfusione 200µ m	Sarstedt, Nü mbrecht, Germania	798.200.500
TRIS	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm	Medical Highlights, Rohrdorf, Germania	CV102-003
Vortex-Genie2	Scientific Industry, New York, USA	SI-0256