Comportamento del tipo di ansia dei ratti testati da elevato più labirinto varia molto a seconda dell'ambiente di test. Qui vi mostriamo come impostazioni di apparato, particolare struttura a braccio, influenzano il comportamento sul labirinto, e spieghiamo un protocollo affidabile per rilevare gli effetti di farmaci ansiolitici. Questa relazione contribuirà alla ricerca di ansia.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sperimentazione animale ansia in ratti: effetti di sporgenze braccio aperto e chiuso braccio parete trasparenza in Elevated Plus Maze Test
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elevato più prova del labirinto è un test comportamento per la valutazione animale ansia nei roditori. Anche se questo test è ampiamente applicato nel campo della scienza del comportamento, risultati contraddittori sono spesso forniti da diversi laboratori. Per identificare i motivi per i diversi risultati, precedentemente ci siamo concentrati sulle caratteristiche di braccio, che differiscono tra i laboratori, la maggior parte in particolare la presenza/assenza di sporgenze ai lati delle braccia aperte e la trasparenza/opacità delle pareti braccio chiuso. In un rapporto precedente, abbiamo utilizzato un contenitore personalizzato progettato per confrontare il comportamento di ratto su diverse combinazioni di disegni di braccio aperto e chiuso in condizioni sperimentali altrimenti identiche e ha mostrato che le differenze nelle funzionalità di braccio interferiscano con sperimentale risultati. In breve, sporgenze braccio aperto aumentato significativamente l'ansia-come comportamento in ratti, mentre le braccia trasparenti possono inoltre sono diminuite questo comportamento. Inoltre, abbiamo verificato una maggiore sensibilità di rilevazione dell'effetto di un farmaco ansiolitico in una combinazione di braccio aperto no-coralline + braccio chiusa murata opaco rispetto con una combinazione di coralline braccio aperto + braccio chiusa murata trasparente. In questo rapporto, presentiamo il nostro protocollo per l'elevato più la prova del labirinto, con discussione dei risultati chiavi dalla precedente relazione e la nostra esperienza sperimentale. Riteniamo che questa relazione fornirà informazioni utili per i ricercatori che hanno impiegato o che prevede di utilizzare l'elevato più labirinto nei loro studi.
Introduzione
Il numero di pazienti affetti da disturbi dell'umore, tra cui disturbi di ansia e depressione, è in aumento. Anche se lo sviluppo di questi disturbi coinvolge fattori sia genetici che ambientali, i meccanismi patogeni dettagliati non sono ancora pienamente compreso1. Pertanto, la ricerca ha bisogno di concentrarsi su scoprendo i meccanismi di fondo dei disturbi dell'umore, come pure lo sviluppo di farmaci efficaci che hanno meno effetti collaterali.
Test comportamentali per animali da laboratorio sono utili per indagare la funzione superiore del cervello, tra cui emozione. Come comportamento animale è altamente variabile, risultati sperimentali spesso differiscono tra laboratori, anche se era un ceppo inbred identico utilizzati2. Così, i ricercatori devono anche comprendere le caratteristiche di base dei dispositivi sperimentali adottate al fine di fornire risultati affidabili, precisi nel laboratorio.
L'elevato più prova del labirinto è stata istituita per esaminare la reattività emozionale in roditori3,4. L'intero apparato è solitamente situato 500 mm sopra il pavimento e si compone di due aperte e due braccia chiuse che fanno una forma plus. Misurazioni di esplorazione di braccio (compresa la durata e la frequenza delle voci su ciascun braccio), passi comportamenti viaggiati e specificati come frequentanti allungato postura degli animali sottoposti sono registrate durante i periodi d'osservazioni. Da queste misure, animale ansia è stimato come un risultato sperimentale.
L'elevato plus prova del labirinto è utilizzato in tutto il mondo, ma non tutti i laboratori utilizzano la stessa apparecchiatura design5,6, e queste differenze possono influenzare i risultati sperimentali. Ad esempio, le differenze includono la presenza o l'assenza di sporgenze lungo le braccia aperte e/o l'utilizzo di pareti trasparenti o opache per bracciolo chiuso5,6. Le sporgenze lungo a braccia aperte e l'uso di pareti trasparenti per bracciolo chiuso sono stati sviluppati per evitare gli animali cadere l' apparato7e per facilitare le osservazioni comportamentali all'interno dei bracci chiusi, rispettivamente8,9. Anche se ci sono stati alcuni studi che hanno esaminato come i singoli differenze nella struttura del braccio possono influenzare la capacità di rilevare animale ansia1,2,5,10,11 , gli effetti combinati di open (con/senza sporgenza breve) e chiuso (trasparente/opaco pareti) braccio caratteristiche il comportamento animale non è stato ancora studiato.
In un recente rapporto, abbiamo discusso l'effetto di queste combinazioni di disegni di braccio sul comportamento del tipo di ansia in ratti12. In breve, sporgenze braccio aperto aumentato significativamente l'ansia-come comportamento in ratti, mentre le braccia trasparenti possono inoltre sono diminuite questo comportamento. Inoltre, abbiamo verificato più alta sensibilità di rilevazione dell'effetto di un farmaco ansiolitico in una combinazione di braccio aperto no-coralline + braccio chiusa murata opaco rispetto con una combinazione di coralline braccio aperto + braccio chiusa murata trasparente. In questo rapporto, sarà a introdurre il nostro protocollo per l'elevato oltre a labirinto prova, insieme con la discussione dei risultati chiave dalla relazione precedente. Riteniamo che questa relazione fornirà informazioni utili per coloro che sono impiegati o che prevede di utilizzare l'elevato più labirinto nei loro studi.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali descritte qui sono state approvate dalla istituzionale Animal Care e uso Comitato di Meiji University (IACUC 14-0002(1)). Animali utilizzati nei risultati rappresentativi sono stati preparati come segue: ratti maschi Sprague-Dawley sono stati acquistati da una società di animali di laboratorio e stabulati in gruppo di 4 animali per gabbia standard del ratto (W200 × D410 × H250 mm) per almeno una settimana prima dell'inizio della esperimento del comportamento. La camera di stabulazione degli animali era mantenuto in condizioni ambientali standard per luce (12:12 orario di chiaro/scuro con luci alle 10:00 h), temperatura (25,0 ± 0,5 ° C), umidità (55 ± 10%) e ventilazione (10 volte / h), e gli animali hanno avuti ad libitum accesso a cibo ( Oriental lievito Co. Ltd., Tokyo, Giappone) e acqua. Gli animali erano tenuti in una gabbia di standard del ratto (W410 x D250 x H200 mm, Toyoriko Co., Ltd., Aichi, Giappone) con carta biancheria da letto (alfa-dri, LSG Corporatin, Tokyo, Giappone).
1. elevato più l'analisi del labirinto
- Impostare più elevati labirinto apparato in un contenitore su misura (W1, 500 × D1, 500 × H2, 000mm) (Figura 1A) con un quadro di metallo a forma di più 500 mm sopra il pavimento per supportare l'esecuzione braccia di modo (Figura 1B), illuminazione a soffitto, contenitore per illuminare la superficie del labirinto per l'intensità della luce necessaria (Figura 1) e una videocamera digitale nel soffitto centro per abilitare il monitoraggio dei video dal vivo dei test comportamentali (Figura 1).
- Fissare i bracci (x W100 L500 mm) sul quadro a forma di più e quindi fissare la piattaforma centrale quadrata (W100 x D100 mm) al centro dei quattro bracci (Figura 1 -F).
Nota: Nel nostro laboratorio, abbiamo due tipi di braccia aperte (x W100 L500 mm) e due tipi di bracciolo chiuso (L500 x W100 x H450 mm) (Figura 1). Il bracciolo chiuso hanno pareti trasparente o opache (Figura 1), e le braccia aperte sono progettate con o senza una breve cengia (H5 mm, Figura 1E). La piattaforma centrale quadrata (W100 × D100 mm) è posto al centro dei quattro bracci (Figura 1 -F). Così, le seguenti quattro combinazioni di armi possono essere allestite secondo scopo sperimentale: open arms con sporgenze + bracciolo chiuso con pareti trasparenti (sporgenze/trasparente), braccia aperte con sporgenze + bracciolo chiuso con pareti opache (sporgenze/opaco), a braccia aperte senza sporgenze + bracciolo chiuso con pareti trasparenti (No-sporgenze/trasparente) e le braccia aperte senza sporgenze + bracciolo chiuso con opaco pareti (No-sporgenze/opaco). La superficie della pista braccio è nera, per consentire il migliore animale traccia dal software di analisi di comportamento automatizzato, come descritto nella sezione 2, analisi comportamentale. - Regolare l'intensità di illuminazione sulla superficie della parte distale di ogni braccio e la piattaforma centrale per circa 100 Lux.
- Prima di ogni prova, pulire l'intero apparato con soluzione di etanolo 70% e pulire con acqua distillata.
- Fare clic sul pulsante"record" sul registratore su disco rigido per avviare la videocamera digitale che registra comportamento del ratto per la video analisi descritta in sezione 2, analisi comportamentale di imaging.
- Posizionare un animale sulla piattaforma centrale rivolto verso un braccio aperto e consentire la libera esplorazione sull'apparecchio per 5 min.
- Fare clic sul pulsante"stop" sul registratore su disco rigido per completare la registrazione.
- Contare il numero di feci e le minzioni sono dopo il ritorno l'animale sottoposto a test per la camera di stabulazione degli animali.
- Ripetere dal passo 1.4 fino alla fine dell'esperimento.
Nota: Esecuzione di un test a secco viene sempre effettuata prima di iniziare ogni esperimento per verificare che tutte le impostazioni sperimentali sono impostate correttamente prima di eventuali animali da esperimento sono esposti a condizioni sperimentali. In caso contrario, alcuni animali, soprattutto il primo animale potrebbe verificarsi diverse condizioni ambientali (ad es., rumori possibilmente indotti dallo sperimentatore durante la manipolazione e/o animale spunti eventualmente lasciati dall'animale precedentemente testato).
Nota: Quando un animale è in fase di test, gli sperimentatori sono vicino al contenitore. Così, anche se gli sperimentatori non sono visibili il ratto può ancora essere in grado di percepire loro via odore e/o suono.
2. behavioral Analysis
Nota: Analisi comportamentale viene eseguita tramite l'osservazione manuale e software di analisi automatico.
-
Osservazione manuale
- Dopo che l'animale è posto sul davanzale, osservare le seguenti indicazioni: numero delle voci (una voce su un braccio è definita come qualsiasi istanza quando tutti i 4 zampe sono sul braccio), il tempo trascorso su ciascun braccio, e numero di frequentanti allungato posture un braccio aperto di fronte , mentre tirando indietro la piattaforma centrale verso un braccio chiuso.
- Misurare la durata e la frequenza dei comportamenti sopra definito da cronometro e conteggio per 5 min, a partire da quando sono chiuse le porte del contenitore.
-
Analisi automatizzata
- Utilizzando il programma di software disponibile, registrare i seguenti: distanza percorsa, il tempi trascorso in diverse posizioni su braccia aperte (segmenti prossimali, medio e distale dalla piattaforma centrale), e un minuto per minuto analisi del tempo trascorso su aperto e chiuso braccia.
- Fare clic sul pulsante"start" del software di analisi automatizzati allo stesso tempo come l'osservazione manuale inizia (la registrazione si ferma automaticamente se è impostata la durata della registrazione).
Nota: Il software di analisi comportamentale utilizzato in questo studio tracce dell'animale tramite il contrasto con il campo di sfondo; l'animale, che viene assegnata una dimensione fissa, viene identificato come l'oggetto più luminoso e quindi utilizzabile per la tracciabilità degli animali la locomozione del suo punto centrale.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nello studio precedente, abbiamo confrontato gli effetti combinati di sporgenze braccio aperto e trasparenza delle pareti braccio chiuso sui comportamenti esplorativi sul labirinto12. Ratti significativamente speso molto meno tempo a braccia aperte senza sporgenze rispetto su braccia aperte con sporgenze (F [1, 60] = 13,49, P = 0,0005) (Figura 2A). Risultati simili inoltre sono stati trovati per il numero di voci in braccia ap...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Aumenta il numero di pazienti affetti da disturbi psichiatrici, tra cui il disturbo d'ansia, è importante sviluppare studi all'avanguardia per migliorare la comprensione del meccanismo di base di ansia. Per raggiungere questo obiettivo, è anche importante ottimizzare le procedure sperimentali. Di conseguenza, per migliorare l'applicazione di elevato più la prova del labirinto, abbiamo dimostrato l'effetto delle caratteristiche di braccio sui risultati sperimentali utilizzando ratti.
L'elevato ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il signor Akihiro Hirano per la sua assistenza nella produzione dell'apparato su misura. Gli autori vorrei ringraziare il signor Kosuke Takahashi e il signor Shingo Nakajima per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dalla ricerca sul rischio delle sostanze chimiche, salute e assegni di ricerca di laboratorio Scienze, Ministero della salute, del lavoro e Welfare, Giappone (H25-KAGAKU-IPPANN-003) e A Research Project Grant dall'Istituto di scienza e tecnologia Meiji Università, Giappone.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Contenitore personalizzato (W1500 × D1500 & volte; H2000 mm) | NA | NA | Fatto a mano da Mr. Akihiro Hirano |
| Illuminazione | NA | NA | Fatto a mano da Mr. Akihiro Hirano |
| Apparecchio per labirinto sopraelevato | NA | NA | Fatto a mano da Mr. Akihiro Hirano |
| Videocamera digitale | Watec | WAT-250D2 | Qualsiasi videocamera adatta può essere collegata a un registratore su disco rigido per la registrazione dei profili di tracciamento. |
| Registratore su disco rigido | TOSHIBA | RD-R200 | Qualsiasi registratore su disco rigido adatto può essere collegato alla videocamera digitale. |
| Ratti Sprague-Dawley | Charles River Laboratories Giappone, Inc. | NA | Tutti i ratti adatti possono essere utilizzati per il tuo studio |
| Gabbia per ratti standard | Toyoriko | TP-105 | Qualsiasi gabbia per ratti adatta da utilizzare per il tuo studio |
| Strumento per misurare l'intensità della luce | AS ONE | 1-5818-02 | Qualsiasi strumento adatto per misurare l'intensità della luce |
| EthoVision XT versione 8.0 | Noldus | NA | Qualsiasi software adatto per misurare il comportamento animale |
| Diazepam | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | Qualsiasi farmaco adatto può essere utilizzato per il tuo studio |
| Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Qualsiasi farmaco adatto può essere utilizzato per il tuo studio |
Riferimenti
- Nestler, E. J. Role of the Brain's Reward Circuitry in Depression: Transcriptional Mechanisms. Int Rev Neurobiol. 124, 151-170 (2015).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284 (5420), 1670-1672 (1999).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 327 (1), 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
- Violle, N., Balandras, F., Le Roux, Y., Desor, D., Schroeder, H. Variations in illumination, closed wall transparency and/or extramaze space influence both baseline anxiety and response to diazepam in the rat elevated plus-maze. Behav Brain Res. 203 (1), 35-42 (2009).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 21-30 (1996).
- Martinez, J. C., Cardenas, F., Lamprea, M., Morato, S. The role of vision and proprioception in the aversion of rats to the open arms of an elevated plus-maze. Behav Processes. 60 (1), 15-26 (2002).
- Anseloni, V. Z., Brandao, M. L. Ethopharmacological analysis of behaviour of rats using variations of the elevated plus-maze. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 533-540 (1997).
- Anseloni, V. Z., Motta, V., Lima, G., Brandao, M. L. Behavioral and pharmacological validation of the elevated plus maze constructed with transparent walls. Braz J Med Biol Res. 28 (5), 597-601 (1995).
- Hagenbuch, N., Feldon, J., Yee, B. K. Use of the elevated plus-maze test with opaque or transparent walls in the detection of mouse strain differences and the anxiolytic effects of diazepam. Behav Pharmacol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Fernandes, C., File, S. E. The influence of open arm ledges and maze experience in the elevated plus-maze. Pharmacol Biochem Behav. 54 (1), 31-40 (1996).
- Horii, Y., Kawaguchi, M. Higher detection sensitivity of anxiolytic effects of diazepam by ledge-free open arm with opaque walled closed arm elevated plus maze in male rats. Behav Brain Res. 294, 131-140 (2015).
- Santos, R. O., et al. Evaluation of the effect of acute sibutramine in female rats in the elevated T-maze and elevated plus-maze tests. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 114 (2), 181-187 (2014).
- Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Dev Psychobiol. 52 (8), 731-739 (2010).
- Horii, Y., et al. Male Hatano high-avoidance rats show high avoidance and high anxiety-like behaviors as compared with male low-avoidance rats. Exp Anim. 61 (5), 517-524 (2012).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
- Yang, Y., et al. Behavioral and pharmacological investigation of anxiety and maternal responsiveness of postpartum female rats in a pup elevated plus maze. Behav Brain Res. 292, 414-427 (2015).
- Albani, S. H., et al. Behavior in the elevated plus maze is differentially affected by testing conditions in rats under and over three weeks of age. Front Behav Neurosci. 9, 31(2015).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
