Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.
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Articolo metodologico
Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Valutazione tossicologica è cruciale per la comprensione degli effetti delle sostanze chimiche sugli organismi viventi nei campi di scienze biologiche di base e applicata. Un suolo non mammiferi tondo verme Caenorhabditis elegans, è un organismo modello prezioso per gli studi di tossicologia grazie alla sua comodità e la mancanza di problemi di etica animale confrontato con sistemi animali mammiferi. In questo protocollo, è descritta una procedura dettagliata di valutazione tossicologica delle sostanze chimiche in c. elegans . Una clinica della droga anticancro, etoposide, che gli obiettivi umani topoisomerasi II e inibisce la replicazione del DNA delle cellule tumorali umane, è stata selezionata come un prodotto chimico di test del modello. Età-sincronizzato di c. elegans uova sono stati esposti a solfossido dimetilico (DMSO) o etoposide, e quindi la crescita di c. elegans è stata monitorata ogni giorno per 4 giorni tramite l'osservazione del microscopio stereo. Il numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con DMSO o etoposide è stato contato anche utilizzando il microscopio stereo. Etoposide trattamento significativamente influenzato la crescita e la riproduzione di c. elegans. Tramite il confronto del numero totale di uova deposte da vermi con periodi differenti di trattamento di sostanze chimiche, può essere deciso che la tossicità delle sostanze chimiche sulla riproduzione di c. elegans è reversibile o irreversibile. Questi protocolli possono essere utili per sia lo sviluppo di varie droghe e valutazione del rischio di tossici ambientali.
Introduzione
Valutazione tossicologica è essenziale per lo sviluppo di prodotti farmaceutici, nutraceutici e cosmeceutici, come pure la valutazione del rischio di varie tossine ambientali. Il modello di roditore è uno dei più popolari in vivo sistemi sperimentali per questo studio di tossicologia; in alternativa, gli organismi non derivanti da mammiferi come c. elegans sono anche ampiamente utilizzati. Modelli di valutazione tossicologica non derivanti da mammiferi sono favorevoli a causa non solo animale questioni etiche, ma anche la loro convenienza e utilità considerando il rapporto costo-efficacia, manutenibilità, velocità e riproducibilità1,2 ,3,4.
C. elegans, un suolo tondo verme, è stato sfruttato come animale modello in vari ricerca fondamentale e applicata, chimica e biologia. È un lungo 1 mm, trasparente nematode, che semplicemente è tenuto in solido o liquido Nematode crescita Media (NGM) alimentati con il ceppo batterico Escherichia coli OP50. C. elegans ha un ciclo di vita breve, e il selvaggio-tipo N2 c. elegans depone circa 300 uova. Di conseguenza, si propaga facilmente per essere utilizzati come materiali sperimentali3,4,5. C. elegans è stato anche ampiamente utilizzato negli studi tossicologici di molti farmaci e inquinanti ambientali6,7,8,9.
Poiché molti farmaci antitumorali destinazione rapida divisione delle cellule tumorali, essi possono anche danneggiare le cellule normali quali midollo osseo, epitelio intestinale e cellule del follicolo pilifero si dividono rapidamente. Ad esempio, farmaci antitumorali inibitori di topoisomerasi target il processo di replica del DNA delle cellule tumorali; di conseguenza, essi inibiscono anche le cellule normali si dividono rapidamente. Ogni organismo vivente ha le topoisomerasi e questi topoisomerase inibitori più probabile impatto ambientale degli ecosistemi6,10,11. Così, una piattaforma di valutazione tossicologica di droga utilizzando un animale modello è utile per sia lo sviluppo di prodotti farmaceutici e valutazione del rischio ambientale.
In questo articolo, descriviamo i protocolli dettagliati per testare la tossicità di etoposide, che è un agente anticancro di clinico che obiettivi topoisomerasi II, come un prodotto chimico tossico di modello c.elegans. Per questo scopo, descriveremo il metodo di misurazione della dimensione corporea e il numero totale di uova deposte in c. elegans trattati con etoposide.
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Protocollo
Nota: l'intero esperimento deve essere eseguita in un laboratorio isolato pulito mantenuto a 20 ° C con basso accumulo di polvere e con riduzione al minimo della contaminazione durante la movimentazione batterica e vite senza fine. Per questo scopo, esperimenti devono essere eseguiti sotto la fiamma di una lampada di alcol o utilizzando un banco pulito.
1. manutenzione di c. elegans e uovo preparazione per il Test di chimica
- Maintain c. elegans N2 (var. Bristol) su una piastra di agar NGM alimentata con live OP50 Escherichia coli a 20 ° C 12 , 13.
- Preparare uova di età-sincronizzati utilizzando candeggina soluzione trattamento 5 o il tempo delle uova di covata metodo 6 , 14 , 15.
Nota: prima di preparazione di uovo, cappotto con la piastra NGM etoposide-contenente inattivati OP50 Escherichia coli come descritto di seguito. E. coli inattivati OP50 è utilizzato per ridurre al minimo l'attività metabolica di e. coli 6 , 16.
2. Preparazione di inattivati Escherichia coli OP50 al Feed C. elegans durante la prova di tossicità
- preparare 500 mL di terreno di doppio lievito tryptone (DYT) come descritto nella tabella 1 e inoculare una singola colonia di e. coli OP50 coltivati su un agar di Luria-Bertani (LB) piastra 5.
- Incubare il OP50 di Escherichia coli in un incubatore d'agitazione per 14 h a 37 ° C e 150 giri/min.
- Dopo centrifugazione a 3.220 x g e a 20 ° C per 30 minuti, rimuovere il surnatante tutto DYT mezzo e aggiungere una pre-miscela di 25 mL di buffer di S, 250 µ l di 1 M MgSO 4 e 25 µ l di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo). Tutte queste soluzioni sono sterile.
- Risospendere i batteri e trasferirli in un tubo di plastica usa e getta da 50 mL.
- Per l'inattivazione termica, incubare il sedimento OP50 di Escherichia coli in un bagnomaria per 30 min a 65 ° C.
- Raffreddare fino a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Questo può essere immagazzinato per fino a un mese.
3. Preparazione di NGM piastre contenenti sia 1% DMSO o 750 µM Etoposide
- preparare due bottiglie di vetro pulito 200 mL. Aggiungere 0,6 g di NaCl, 0,5 g di peptone, 3,4 g di agar agar e 195 mL di acqua distillata e un agitatore magnetico per una bottiglia. Aggiungere un agitatore magnetico per altre la bottiglia vuota.
- Bottiglie di autoclave questi due per 15 min a 121 ° C e quindi raffreddare le bottiglie in un bagno d'acqua per 30 minuti a 55 ° C.
- Aggiungere 0,2 mL di 1 M CaCl 2, 0,2 mL di colesterolo 5 mg/mL, 0,2 mL di 1 M MgSO 4 e 5 mL di 1 M KPO 4 (tutte queste soluzioni sono sterili) e poi mescolarle mediante agitazione magnetica su una piastra calda a 55 ° C.
- Dividere il mezzo NGM misto in due bottiglie con lo stesso volume (100 mL ciascuno). Successivamente, aggiungere 1 mL di DMSO per una bottiglia, mescolarlo nuovamente utilizzando l'agitazione magnetica. Conservare l'altra bottiglia in un bagno di acqua a 55 ° C fino al passaggio successivo. Aliquotare 3 mL di terreno contenenti DMSO a ogni 35 x 10 mm 2 piastra di Petri. Circa 33 contenenti DMSO NGM piastre possono essere realizzate da questo passaggio.
- Mescolare l'altra bottiglia utilizzando l'agitazione magnetica, aggiungere 1 mL di 75mm etoposide (stock dissolto in DMSO), mescolare di nuovo e ripetere la procedura di aliquota (punto 3.4). Circa 33 etoposide (750 µM)-contiene tavole NGM può essere fatto da questo passaggio.
Nota: In correlato precedente carta 6, abbiamo testato 0, 250, 500 e 1.000 µM di etoposide. Base a tali dati, abbiamo scelto il 750 µM di etoposide dose in questo paper. - Cool giù le piastre NGM contenenti sostanze chimiche a temperatura ambiente lasciandoli a temperatura ambiente per circa 3 h e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Nel caso di prodotti chimici sensibili alla luce, bloccare la luce per ridurre al minimo la decomposizione indotta dalla luce.
Nota: Facoltativamente, rendere un piatto normale di NGM senza prodotti chimici per l'analisi, che può essere eseguita utilizzando due diversi trattamenti chimici condizioni come descritto di seguito di deposizione delle uova. - Aggiungere 100 µ l di e. coli OP50 inattivati al calore (come descritto nella sezione 2) e pubblicizza su ogni piastra NGM. Lasciar asciugare durante la notte in un'incubatrice di c. elegans a 20 ° C per il test chimico
4. Misura della crescita di c. elegans
- trasferimento l' età-sincronizzato di c. elegans uova alla piastra NGM completata con 1% DMSO o 750 µM etoposide.
- Incubare c. elegans in un incubatore a 20 ° C per 4 giorni. Osservare i vermi utilizzando un microscopio stereo e prendere le immagini al microscopio ogni giorno. Solitamente 20 ingrandimenti (obiettivo obiettivo 1x, ingrandimento zoom 2x e obiettivo oculare 10x) sono adatto per l'osservazione di crescita di c. elegans. Anche prendere un'immagine microscopica di micrometro per microscopio per la calibrazione di dimensione verme.
Nota: Inedia riguarda il test di tossicità. Di conseguenza, nutrire con batteri sufficienti o regolare il trasferito c. elegans uovo numeri all'inizio. Osservare fino a 3 giorni per escludere la possibilità di morire di fame. - Misurare la lunghezza di corpo di c. elegans trattati con DMSO o etoposide in ciascun punto di tempo utilizzando il software ImageJ.
Nota: Per ogni misurazione del campione, 50 vermi sono sufficienti per l'analisi statistica.- In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (' File ' → ' aperto ').
Nota: L'immagine di micrometro e immagini di vite senza fine (passo 4.2) devono essere lo stesso ingrandimento. - Trascinare una linea di 1.000 µm sull'immagine di calibrazione del micrometro utilizzando ' linea retta ' strumento.
- Clic ' Analyze ' → ' Imposta scala ' e 1.000 e µm in ingresso il ' noto distanza ' casella e ' unità di lunghezza ' scatola, rispettivamente. Verifica ' Global ' e fare clic su ' OK '.
- Aprire le immagini di vite senza fine (' File ' → ' aperto '). Disegnare una linea lungo la caratteristica di ogni verme utilizzando ' linea a mano libera ' strumento. Ottenere i dati di lunghezza del corpo facendo ' Analyze ' → ' misura '.
- Ripetere questi passaggi per 50 worm.
- In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (' File ' → ' aperto ').
5. C. elegans uovo posa Assay
uova- Incubare l'età-sincronizzati sul NGM piastra contenente DMSO o etoposide per 64 h (prima della nascita prima) fino allo stadio adulto giovane a 20 ° C.
Nota: È facoltativo utilizzare i vermi da esperimenti di misura la crescita. È conveniente fare la misura di crescita e uovo saggio posa insieme.
Piastre di - trasferire 5 vermi adulti per il nuovo NGM senza prodotti chimici (condizione 1, trattamento chimico entro un certo periodo di tempo, dalle uova alla fase adulta giovane) o nuova piastra NGM contenente il pretrattamento chimico stesso (condizione 2, l'esposizione continua di prodotti chimici attraverso il periodo sperimentale nel complesso) e poi li Incubare per 24 h.
Nota: Si consiglia di rendere replica utilizzando piastre NGM 3-5 per ogni trattamento; questi replica può essere utilizzato per l'analisi statistica. - Trasferire alla nuova piastra NGM come descritto sopra e contare il numero di uova ogni giorno. Contare i vermi che strisciò fuori, è deceduto ed erano internamente tratteggioa cura di
- Ripetere questi passaggi fino a quando i vermi non più uova, solitamente in 5 giorni.
- Calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine da ogni piatto e sommare questi valori ogni giorno per 5 giorni determinare il numero totale di uova deposte.
Nota: Escludere il numero di vermi che strisciò fuori ed internamente covato dal calcolo.
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Risultati
Il trattamento di etoposide (24-96 h) ha ritardato significativamente la crescita di c. elegans. Dopo 96 h di incubazione, etoposide-trattati worm è cresciuto a 0,86 mm di lunghezza del corpo, mentre i vermi veicolo-trattati è cresciuto a 1,04 mm (Figura 1). Ritardo della crescita è stata osservata anche apparentemente sotto osservazione stereo microscopio (Figura 2). Abbiamo iniziato a vedere le uova dai vermi veicolo-t...
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Discussione
In questo articolo, descriviamo la valutazione della tossicità delle sostanze chimiche in c. elegans, un nematode del terreno, utilizzando etoposide come un esempio di tossico. Per questo scopo, abbiamo utilizzato due condizioni sperimentali. Nel primo set, c. elegans sono state coltivate su etoposide contenente tavole dalle uova alla fase adulta giovane, e quindi i vermi sono stati ammessi a deporre le uova sulle piastre di NGM normale senza prodotti chimici. Nel secondo set sperimentali, c. elegan...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dall'assegno di ricerca intramurale Korea Institute of Science e Technology (2E27513) e l'alta sul valore aggiunto cibo tecnologia sviluppo programma (IPET) finanziato il Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Fotocamera per microscopio | Jenopitk, Progress Gryphax, Germania | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 & volte; 10 mm Piastra di Petri | SPL Life Sciences, Corea del Sud | 10035 | |
| 90 & 15 mm Petri | dish SPL Life Sciences, Corea del Sud | 10090 | |
| Stereomicroscopio | Nikon, Giappone | SMZ800N | |
| Estratto di lievito | Becton Dickinson, USA | 212750 |
Riferimenti
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
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