Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule

Sommario

Migrazione delle cellule è essenziale per lo sviluppo, manutenzione dei tessuti e riparazione e tumorigenesi ed è regolata da fattori di crescita, chemochine e citochine. Questo protocollo descrive il dosaggio di dot, un'analisi bidimensionale, senza vincoli di migrazione per valutare il fenotipo migratore di strati delle cellule allegata, coesa in risposta a stimoli microambientali.

Abstract

Anche se gli organismi complessi appaiono statici, i loro tessuti sono sotto un continuo turnover. Come cellule età, muoiono e sono sostituite da nuove cellule, cellule spostano all'interno dei tessuti in maniera ben orchestrata. Durante lo sviluppo del tumore, questo equilibrio è disturbato, e lasciano le cellule del tumore dell'epitelio di origine per invadere il microambiente locale, viaggiare in luoghi distanti e in definitiva formare tumori metastatici ai luoghi distanti. Il metodo di dot è un semplice, bidimensionale migrazione senza vincoli, per valutare il movimento netto di strati delle cellule in una zona senza cellula e per analizzare i parametri della migrazione cellulare usando la formazione immagine di time-lapse. Qui, il dosaggio di dot è dimostrato utilizzando un umani dilaganti, la linea cellulare del cancro al seno, MCF10CA1a, di formazione di colonie di polmone per analizzare la risposta migratoria delle cellule di fattore di crescita epidermico (EGF), che è noto per aumentare il potenziale maligno delle cellule di cancro al seno e per modificare il fenotipo migratorio delle cellule.

Introduzione

Saggi di migrazione sono ampiamente utilizzati per valutare il potenziale invasivo e metastatico delle cellule del tumore in vitro. Più comunemente, la ferita o dosaggio zero viene utilizzato per valutare la migrazione epiteliale fogli in una cella deselezionata zona^1,2,3. Per eseguire l'analisi di gratta e Vinci, le cellule sono placcate in un monostrato e un "graffio" o zona senza cellula viene creato con un puntale. Il dosaggio zero è facile da configurare con i rifornimenti di coltura del tessuto comunemente disponibili e possa essere eseguito in piastre multi-po....

Protocollo

1. rivestimento di piatti (giorno 1)

Nota: Assicurarsi di non lasciare impronte digitali o sporcizia sul fondo della piastra nel maneggiarlo.

1. Scongelare il collagene del mouse IV sul ghiaccio e diluirlo con 50mm HCl (pH 1.3) per preparare 3 mL di 10 µ g/mL collagene IV soluzione.
   Nota: Collagene precipiterà a 37 ° C. Pertanto è importante mantenere la soluzione di collagene a bassa temperatura durante lo scongelamento e lavorare con esso. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento di preparare aliquote di dimensioni appropriate e la loro conservazione a-80 ° C.
2. Aggiungere 250 µ l di soluzione di collagene IV ad ogni pozzetto 12-....

Risultati

Il dosaggio di puntino qui presentato (Figura 1) è stato effettuato usando dilagante, colonie del polmone cellule di cancro al seno (MCF10CA1a) come sistema modello. Il dosaggio di puntino produce punti di cellule altamente riproducibile anche in mano di principianti, che lo rende un comodo e facile da eseguire test (Figura 1D). Il dosaggio di dot combinato con lui la macchiatura, o l'imaging time-lapse e success.......

Discussione

Durante le cellule di progressione del tumore migrano dal tessuto di origine di invadere il tessuto circostante e riprodurrsi per metastasi ai siti distanti¹⁵. Migrazione delle cellule da una colonia di cellule può essere osservato nell'analisi della dot. Qui, il dosaggio di dot è illustrato analizzando il fenotipo migratorio delle cellule di cancro al seno umano in risposta a EGF.

Per ottenere risultati accurati e riproducibili diverse fasi d'impostazione del punto sag.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule MCF10CA1a	Karmanos Research Institute	Cellule N/A	utilizzate per il test
del collagene di topo IV	BD Biosciences	354233	utilizzate per rivestire le piastre
tripsina / EDTA	Thermo Fisher	25300054	utilizzato per rimuovere le cellule dalle piastre di coltura tissutale
DPBS	Mediatech	21-031-CV	utilizzato per lavare le cellule
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	utilizzato come terreno di coltura
siero di cavallo	Thermo Fisher	26050088	utilizzato per integrare il terreno di coltura
Piastra inferiore in vetro a 12 pozzetti	MatTek	P12G-1.5-14-F	utilizzato per la crescita di cellule per l'imaging
EGF (fattore di crescita epidermico, ricombinante umano)	Peprotech	AF-100-15	utilizzato per stimolare le cellule
libere da acidi grassi BSA	Sigma	A8806-1G	utilizzato per fare tampone per EGF
ematossilina	Sigma	HHS32	utilizzato per colorare le colonie
eosina Microscopia	elettronica Scienze	26051-10	utilizzato per colorare le colonie
37 ° C, 5% CO2 incubatore	Sanyo	modello MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver con camera incubatrice e stadio motorizzato	Zeiss	modello Axio Observer.Z1	utilizzato per l'imaging time lapse
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	utilizzato per l'imaging timelapse in combinazione con Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software utilizzato per l'imaging time lapse
microscopio invertito	Olympus	modello IX70	utilizzato per contare le cellule e per controllare le colonie in coltura tissutale
scatola di plastica	Lock& Serratura	N/A	utilizzata come camera umida (è possibile utilizzare qualsiasi scatola di plastica a chiusura ermetica che si adatti alle piastre)