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Articolo metodologico

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

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⸱

DOI:

10.3791/56453

⸱

6 febbraio 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

Abstract

Progressione meiotica nei maschi è un processo che richiede l'azione concertata di un numero di eventi cellulari altamente regolamentati. Errori che si verificano durante la meiosi possono portare alla sterilità, perdita di gravidanza o difetti genetici. Che inizia all'inizio della pubertà e proseguendo per tutta l'età adulta, onde continue semi-sincrone di spermatociti subiscono la spermatogenesi e alla fine formano spermatozoi aploidi. La prima ondata di spermatociti di mouse in fase di iniziazione meiotica appaiono al 10 ° giorno post-parto (dpp 10) e vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero come sperma maturo a 35 dpp. Pertanto, è preferibile utilizzare topi all'interno di questo intervallo di tempo dello sviluppo al fine di ottenere popolazioni altamente arricchiti di interesse. Analisi delle fasi di rara delle cellule è più difficile in più vecchi topi grazie al contributo di successive ondate di spermatogenesi, che aumentano la diversità delle popolazioni cellulari all'interno dei tubuli. Il metodo qui descritto è una tecnica facile da implementare per la valutazione citologica delle cellule trovate all'interno dei tubuli seminiferi dei topi, tra cui spermatogoni, spermatociti e spermatidi. La tecnica di squash tubulo mantiene l'integrità delle cellule germinali maschili isolate e permette l'esame delle strutture cellulari che non sono facilmente visibili con altre tecniche. Per illustrare le possibili applicazioni di questa tecnica di squash tubulo, gruppo fusello è stato monitorato in spermatociti progredendo attraverso la profase alla metafase di transizione (transizione G2/MI). Inoltre, duplicazione centrosoma, inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) e formazione di mazzo del cromosoma sono stati valutati come esempi delle strutture citologiche che possono essere osservate utilizzando questo metodo di squash del tubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per individuare difetti specifici durante la spermatogenesi che sono causati dalla mutazione o perturbazione esogeni, e quindi, contribuisce alla nostra comprensione dei meccanismi molecolari della spermatogenesi.

Introduzione

Meiosi sono un evento cellulare complesso in cui un singolo ciclo di replicazione del DNA è seguito da due successivi cicli di divisione cellulare. Diversi eventi di meiosi specifici devono essere coordinati durante le fasi iniziali della meiosi per assicurare la segregazione del cromosoma accurata. Questi eventi comprendono il completamento di ricombinazione omologa, co-orientamento della sorella cinetocori durante la prima divisione meiotica e la perdita graduale della coesina complessi per risolvere chiasmata tra omologhi. Regolazione precisa di questi processi è necessaria per mantenere la fertilità e cromosoma malsegregazione di eventi che possono portare a disturbi dello sviluppo genetici e aborto spontaneo1.

Mentre gli eventi chiavi della meiosi si svolgono sia maschi che femmine, esistono differenze significative di temporale e meccanicistiche tra spermatogenesi e oogenesi2. Ad esempio, durante la meiosi femminile, profase si verifica durante lo sviluppo embrionale e si arresta nella fase di dictyate fino alla pubertà. Al contrario, la spermatogenesi inizia alla pubertà e progredisce in onde tutta la vita adulta senza arresto. Le differenze tra maschio e femmina meiosi sottolinea la necessità di sviluppare metodi che sono specificamente orientate verso valutare questi processi sia spermatociti e ovociti. Attualmente, valutare la progressione meiotica in gran parte si basa sull'uso di cromatina spread3,4,5. Mentre gli spread della cromatina sono utili per studiare i cromosomi meiotici, riescono a preservare l'integrità cellulare, impedendo la valutazione delle strutture cellulari quali mandrino microtubuli, centrosomi, l'involucro nucleare e gli allegati del telomero. Live imaging e tecniche di coltura a lungo termine notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione della meiosi femminile; approcci simili per visualizzare l'intera cellula intatta, tuttavia, sono meno frequentemente implementati per lo studio della spermatogenesi6,7. Per visualizzare gli eventi dinamici durante meiosi maschile, abbiamo adattato stabilito tubulo squash tecniche per valutare rapidamente le caratteristiche citologiche di sviluppare del mouse spermatociti8,9. Il metodo qui descritto mantiene l'integrità della cellula, permettendo lo studio di strutture cellulari multiple durante diverse fasi della spermatogenesi.

Questa tecnica di squash del tubulo è un approccio a cellula intera, che consente la valutazione delle strutture cellulari tramite microscopia di immunofluorescenza. Approcci comuni istologici di visualizzare progressione meiotica in di topo maschio come haematoxylin ed eosina di testicoli di paraffina ed etichettatura immunofluorescente di cryosections consentono un'ampia panoramica della progressione meiotica. Tuttavia, queste tecniche non riescono a risolvere le singole cellule nella misura necessaria per un'analisi dettagliata degli eventi che si verificano durante meiosi10,11. Tecniche alternative per visualizzare processi meiotici si basano su interruzioni significative chemiosmotica spermatocita per isolare e difficoltà materiali nucleari3,4,5. Questi trattamenti chimici ostacolano l'osservazione di tipi cellulari diversi da spermatociti primari. Un metodo recentemente descritto da Namekawa ha permesso alla comunità di ricerca di preservare l'architettura nucleare di spermatociti isolati, ma richiede l'uso di un cytospin e accessori che non siano prontamente disponibili per alcuni laboratori4. Al contrario, la tecnica di squash tubulo richiede solo attrezzature che è generalmente standard nella maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule.

Il metodo di squash tubulo qui descritto può essere utilizzato per visualizzare i tipi di cellule diversi trovati all'interno del tubulo seminifero, comprese cellule di sertoli, spermatogoni, spermatociti primari e secondari e spermatidi. Accoppiando questa tecnica con la prima ondata vicino-sincrono della spermatogenesi in topi giovani, è possibile ottenere arricchiti popolazioni delle cellule spermatogenetiche mentre progrediscono attraverso meiosi12. Questo processo permette l'analisi dettagliata dei processi durante la spermatogenesi, quali eventi precoci profase, il G2/MI e la metafase per transizioni anafase e spermiogenesi. Inoltre, preparazioni di squash tubulo possono essere utilizzati per visualizzare le caratteristiche citologiche dei cromosomi (ad es. interchromatid domini (ICD) e cinetocori) e centrosomi (centrioli e pericentriolar materiale/matrici). Il metodo di zucca può essere facilmente eseguito in parallelo con altri approcci sperimentali, come spread della cromatina ed estrazione di proteine. Inoltre, questa tecnica è stata modificata con successo per depositare le cellule spermatogenetiche viventi su slitte per la visualizzazione diretta13.

Il metodo qui descritto richiede una tecnica di squash del tubulo seminifero cellula intera per analizzare la transizione G2/MI in topi C57BL/6J wild-type. Le caratteristiche citologiche di spermatociti primari entrando la prima divisione meiotica sono state visualizzate con microscopia di immunofluorescenza per osservare il fuso meiotico. Questa tecnica versatile può essere facilmente modificata per visualizzare altre fasi meiotic e diversi tipi di cellule. La tecnica è anche favorevole alla strategie di visualizzazione alternativi, come DNA e RNA pesce approcci.

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Protocollo

L'uso di topi è stato approvato dal istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su giovanile (20-26 giorni post-partum, dpp) topi C57BL/6J, approfittando della prima ondata semi-sincrona della spermatogenesi. Tuttavia, questa tecnica può essere eseguita anche utilizzando topi adulti.

1. dissezione e isolamento dei tubuli seminiferi del mouse

  1. Preparare la correzione/soluzione e anticorpo diluizione buffer di lisi (ADB) descritto nella tabella 1 e tabella 2.
  2. Preparare una capsula di Petri 35 mm con 3 mL di 1x tampone fosfato salino (1x PBS, pH 7.4) e un altro piatto di 35mm con 2 mL di soluzione di correzione/Lisi per topo.
  3. Sacrificare il mouse tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia e spruzzare l'addome ventrale con etanolo al 70%. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Quindi rimuovere i testicoli, tirando il grasso epididimario usando il forcipe ed evitare di disturbare la tunica albuginea. Posizionare i testicoli in una capsula Petri 35 mm contenente 1X PBS.
    Nota: Utilizzare la prima ondata di spermatogenesi al fine di osservare una popolazione delle cellule arricchite di interesse14. Fasi specifiche della spermatogenesi sono arricchite alle età del mouse differenti (tabella 3).
  4. Rimuovere il testicolo albuginea di Tunica perforando il tessuto con una pinza punta tagliente e raccogliere i tubuli seminiferi sciolti. Trasferire i tubuli una nuova 35 mm piastra Petri contenente 2 mL di soluzione di correzione/lisi.
  5. Incubare i tubuli nella soluzione fix/Lisi per 5 min a temperatura ambiente.

2. preparazione del tubulo seminifero

  1. Preparare un vetrino di vetro rivestito di poli-L-lisina delineando i bordi della diapositiva con una penna di liquido bloccante.
  2. Applicare 100 µ l di soluzione di correzione/Lisi al centro del vetrino.
  3. Utilizzando pinze sterili e forbici delicatamente a pezzi stuzzicare i tubuli seminiferi. Taglio fuori tubulo lungo singolo segmenti di circa 20 mm di lunghezza.
    Nota: Per visualizzare le strutture che sono sensibili all'esposizione prolungata fissativo, quali i centrosomi, separare i tubuli prima in PBS 1X, quindi tritare direttamente i tubuli sulla superficie delle diapositive di poli-lisina rivestito in 100 µ l di soluzione di correzione-lisi.
  4. Trasferimento cinque segmenti di tubulo seminifero lungo 20 mm per il vetro rivestito di poli-L-lisina preparato diapositiva contenente soluzione di correzione/lisi.
  5. Utilizzando forbici sterili triti tubuli seminiferi in segmenti di 1,5 a 3,0 mm.
  6. Utilizzando pinze sterili disporre i segmenti tubulo il vetrino in modo che nessun tessuto si sovrappone, e i tubuli sono distribuiti in modo uniforme.
    Nota: Il numero di segmenti tubulo su un vetrino ottimale è tra 20 e 40.

3. lo schiacciamento dei tubuli seminiferi

  1. Trasferire il vetrino contenente segmenti Tubulo seminifero dispersi su un benchtop. Rimuovere il liquido in eccesso usando un laboratorio per evitare di perdere tessuto durante il passaggio di squash.
  2. Applicare un vetrino coprioggetti (22 x 60-1.5 mm) sopra il vetrino ed esercitare una pressione con il tallone del palmo della mano per 10-20 secondi. È importante applicare forza sufficiente a disperdere spermatociti da tubuli seminiferi.
    Nota: Osservare i tubuli utilizzando un microscopio di dissezione al fine di ottimizzare il passaggio schiacciamento, in modo che tutti i segmenti del tubulo sono interrotti.
  3. Usando il forcipe di diapositiva, immediatamente flash congelare il vetrino in un dewar piccolo liquido N2 per 15 secondi, o fino a quando il liquido non cessa di bolla. Se immunolabeling immediatamente, rimuovere il vetrino coprioggetto con una lama di rasoio bordo dritto, bene punta forcipe o ago da 21 gauge.
    Nota: Per ottenere risultati ottimali, marcatura le diapositive immediatamente (Vedi punto 4). Tuttavia, a questo punto diapositive possono essere conservati a-80 ° C fino a due settimane. Per ottimizzare la durata delle proteine e strutture cellulari, immediatamente archiviare le diapositive sul ghiaccio secco o trasferimento in un congelatore a-80 ° C e mantenere il coprioggetto sul vetrino. Quando immunolabeling memorizzati diapositive, è necessario rimuovere il vetrino coprioggetto immergendo i vetrini in liquido N2 per 15 secondi, come descritto al punto 3.3.

4. Immunolabeling di tubuli seminiferi montati

  1. Immergere il vetrino in 1X PBS e lavare tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS.
    Nota: Mai lasciare i vetrini a completamente asciutto durante immunolabeling.
  2. Applicare 1 mL di tampone di diluizione di anticorpo su lastra di vetro viene bloccato per 1-2 h in una camera umidificata.
  3. Rimuovere il tampone di diluizione dell'anticorpo e applicare 100 µ l di anticorpo primario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo in una camera umidificata.
    Nota: Per risultati ottimali, Incubare gli anticorpi primari durante la notte a 4 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm. Convalidare e ottimizzare gli anticorpi primari15.
  4. Sciacquare i vetrini tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin 50 mL contenente 1X PBS.
    Nota: Per migliorare i lavaggi, agitare Coplin vasetti utilizzando una piccola ancoretta magnetica e posizionare su una piastra magnetica a bassa velocità o la vaschetta di Coplin su un mixer da tavolo a bassa velocità.
  5. Applicare 100 µ l di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo per 1-1,5 h in una camera umidificata a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in una scatola scuro per evitare foto imbianchimento di anticorpi coniugato fluoroforo.
    Nota: Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm.
  6. Sciacquare i vetrini due volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS.
  7. Montare i vetrini in mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e applicare i coprioggetti (22 x 60-1,5 mm).
  8. Sigillare i coprioggetti per le diapositive con smalto trasparente per preservare le diapositive e impediscono il movimento di lamelle.

5. analisi e imaging del tubulo squash preparati

  1. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con fase automatizzata che consente il movimento dell'asse z preciso e una telecamera ad alta risoluzione per la cattura delle immagini. In alternativa, utilizzare un microscopio confocale laser.
    Nota: È possibile utilizzare qualsiasi software e hardware disponibile per questo passaggio. Ad esempio, immagini visualizzate in Figura 1 e Figura 2 sono state catturate utilizzando un Zeiss cella osservatore Z1 collegata a un'ORCA-Flash 4.0 CMOS telecamera e analizzati con il software di immagine di Zeiss ZEN 2012 blue edition.
  2. Valutare le diapositive utilizzando un obiettivo X 20 per determinare la qualità della preparazione squash. Diapositive di buona qualità hanno un monostrato di nuclei che sono distribuiti uniformemente.
    Nota: Alcune sezioni della diapositiva possono essere meglio di altri, è utile notare le coordinate di dove le migliori regioni della diapositiva possono essere trovate per ulteriori analisi con maggiore ingrandimento.
  3. Utilizzando il più alto obiettivo di ingrandimento (es. 63X o da 100x), cattura regioni della diapositiva che dispongono di un monostrato coerenza dei nuclei. Una volta selezionata una regione, impostare il superiore e inferiore Z-stack per garantire che tutta la luce messa a fuoco viene catturata.
    Nota: Il numero ottimo di Z-stack catturati tra il limite superiore e inferiore è generalmente indicato con il software di acquisizione di immagini e per ogni obiettivo è diverso.
  4. Utilizzare il software di elaborazione di immagini per compilare un'immagine messa a fuoco estesa profondità. Il software combina la luce messa a fuoco da ogni Z-stack ed è essenziale per l'acquisizione ottima delle preparazioni squash del tubulo.

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Risultati

Qui, abbiamo usato il metodo di squash tubulo visualizzare popolazioni di transitorio delle cellule che subiscono la profase alla metafase (G2/mi) transizione, che sono stati arricchiti dalla raccolta testicoli da topi wild-type giovanili che subiscono la prima ondata della spermatogenesi (24 DPP). Figura 1 raffigura immagini rappresentative delle varie fasi delle cellule che possono essere visualizzate utilizzando il metodo di squash del tubulo. Arricchita d...

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Discussione

Topi hanno dimostrato di essere un organismo modello utile per studiare gli eventi cellulari che regolano la progressione meiotica durante la spermatogenesi. Inoltre, è necessario sviluppare strumenti adatta allo studio della spermatogenesi, perché molti eventi, come uscita dalla Profase Meiotica I, sono sessualmente dimorfica. Questo protocollo descrive un metodo di squash tubulo seminifero per la visualizzazione e lo studio delle diverse fasi della spermatogenesi del mouse. Questo metodo mantiene l'integrità cellulare ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di S.R.W. e J.H.
 

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16% Paraformaldeidemicroscopia elettronica acquosa (EMS)15710
10x PBSQualità biologica119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
Siero di cavalloSigmaH-1270
35 mm x 10 mm Piastra di Petri, sterile, non trattataCellTreatP886-229638
Vetrini in vetro rivestiti in poli-L-lisinaSigmaP0425-72EA
Penna bloccante liquidiMicroscopia elettronica Scienze (EMS)71310
Scatola umidaEvergreen240-9020-Z10
Wheaton Coplin Piatto di colorazione in vetro per 5 o 10 vetriniFisher08-813E
VECTASHIELD Montaggio antisbiadimento Medium conVector LabsH-1200
(22mmx60mm)Fisher12-544-G
Smalto per unghie trasparenteAmazonN/A
Microsopes
NameCompanyNumero di catalogo Comments
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observer Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition software di immagineZeiss
ORCA-Flash 4.0Hamamatsu
Primary Antibodies
NameAziendaNumero di catalogo>Comments
Topo anti-SYCP3Santa Cruzsc-745691 su 50
Coniglio anti-SYCP3Fisher (Novus)NB300-2311 su 1000
Capra anti-SCP3Santa Cruzsc-208451 su 50
umani anti-proteina centromeroincorporati15-2351 su 100
Topo anti-alfa tubulinaSigmaT90261 su 1000
Topo anti-AIM1BD Biosciences611082 1 su 200
Topo anti-γ H2AXThermo FisherMA1-20221 su 500
Topo anti-CENT3AbnovaH00001070-M011 su 200
Coniglio anti-pericentrinaAbcamab44481 su 200
Coniglio anti-REC8Per gentile concessione di  Dr. Karen SchindlerN/A1 su 1000
Scienze della vetrini di copertura per microscopio DAPI Fotocamera CMOS Anticorpi

Riferimenti

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