Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

Summary

L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.

Abstract

Negli ultimi decenni, la prevalenza dei disordini neurodegenerative, quali il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP), è cresciuta. Queste malattie età-associate sono caratterizzate dalla comparsa di aggregati di proteine con struttura fibrillare nei cervelli di questi pazienti. Esattamente perché normalmente solubili proteine subiscono un processo di aggregazione rimane capito male. La scoperta che l'aggregazione proteica non è limitato ai processi di malattia e invece parte del normale processo di invecchiamento consente lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano l'aggregazione proteica, senza l'utilizzo di ectopically espresso umano proteine associate a malattia. Qui descriviamo metodologie per esaminare l'aggregazione proteica inerente in Caenorhabditis elegans attraverso approcci complementari. In primo luogo, esaminiamo come far crescere un numero elevato di età-sincronizzato elegans del c. di ottenere animali invecchiati e presentiamo le procedure biochimiche per isolare altamente insolubile grandi aggregati. In combinazione con un atterramento di genetico mirato, è possibile sezionare il ruolo di un gene di interesse nel promuovere o prevenire l'aggregazione proteica età-dipendente utilizzando sia un'analisi completa con spettrometria di massa quantitativa o un analisi basata su candidati con gli anticorpi. Quindi, questi risultati sono confermati dall'analisi in vivo con animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti-etichettate aggregazione-incline. Questi metodi dovrebbero aiutare a chiarire perché alcune proteine sono inclini ad aggregarsi con l'età e, in definitiva, come mantenere queste proteine completamente funzionale.

Introduction

Misfolding e aggregazione sono riconosciuti come un marchio di garanzia di parecchie malattie neurodegenerative quali AD, PD, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), la demenza frontotemporale (FTD) e molti altri. Per esempio, α-synuclein assembly in fibrille amiloidi che si accumulano come i corpi di Lewy specialmente nel nigra di substantia dei pazienti del Palladio, mentre in misfold di TDP-43 o FUS di pazienti ALS a formare aggregati citoplasmatici a degenerazione dei neuroni di motore. In ciascuno di questi disordini neurodegenerative, meccanismi di mantenimento omeostasi della proteina o proteostasis non riescono ad impedire l'accumulo di proteine misfolded, conseg....

Protocol

Nota: Per una migliore comprensione della procedura, è associato uno schema del flusso di lavoro (Figura 1).

1. crescita di grandi numeri di giovani e invecchiati di c. elegans sottoposti a RNAi Targeting un Gene di interesse

Nota: Uso di c. elegans temperatura-indotta sterile gon-2(q388) mutanti (CF2253) per ottenere grandi popolazioni invecchiato-sincronizzato. Durante tutti i passaggi, è importante lavorare in condizioni semi-sterile con una fiamma aperta e per controllare che nessun contaminazioni (ad esempio con funghi o batteri) sono presenti. Se la tem....

Results

Abbiamo usato i metodi presentati qui per valutare animali come longevi con IIS ridotta modulano l'aggregazione proteica età-dipendente. Mediante Western blot (Vedi punto 2.2, rapida estrazione di proteine insolubili per l'analisi Western blot), abbiamo analizzato il totale e il contenuto di proteina insolubile di young (3 giorno dell'età adulta) e dai vermi (giorno 18 di età adulta) sul controllo RNAi e su RNAi targeting l'insulina / Recettore IGF-1-like daf-2. Abbiamo non osser.......

Discussion

Qui segnaliamo una metodologia per isolare gli aggregati altamente insolubili della proteina da invecchiamento di c. elegans sottoposti a RNAi per l'analisi mediante spettrometria di massa e Western blotting. Mostriamo che miglioramento proteostasis riducendo notevolmente IIS impedisce l'aggregazione proteica età-dipendente. Selezionando specifiche proteine di aggregazione-inclini a iperesprimono in c. elegans, è possibile sezionare ulteriormente i meccanismi che modulano l'aggregazione proteica inerent.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiaschetta di cultura Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, capacità 2.800 ml, con 3 rientranze del deflettore
Tappo a vite a membrana	Schott	1088655	GL45
Miscelatore nutente	VWR	444-0148
Imbuto separatore	Nalgene	4300-1000	Capacità 1.000 ml
1 ml siringa	BD Plastipak	300013
Ago grigio, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Filtri a membrana 0,025 &; M	Millipore	VSWP04700
striscia di pH	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Inibitore della proteasi Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini compresse senza EDTA
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morfolinetsulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	ricombinante, RNaseA senza RNasi
	Soluzione di Promega	A7973
Colorazione totale di protein blot	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot colorante
Colorazione totale del gel proteico	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel color
TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniobicarbonato	Sigma-Aldrich	09830
Tripsina modificata di grado di sequenziamento	Promega	V5111
Tag isobarici per quantificazione relativa e assoluta Reagenti	Sciex	4352135	iTRAQ Kit multiplex
Centrifuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuga Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuga 5424R	Eppendorf
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentratore Plus	Eppendorf	5305000304	Evaporatore centrifugo
Stereomicroscopio fluorescente M165 FC	Leica		con obiettivo Planapo 2.0x
Microscopio da dissezione	Leica		Leica S6E
Microscopio ad alto ingrandimento Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Con obiettivo PlanAPOCHROMAT 20x e Zeiss Axio Cam MRm
Software
Software di analisi delle immagini	ImageJ
Analisi dei dati della spettrometria di massa	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
Ceppo di E.coli
OP50	CGC
RNAi batteri
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutanti
CF2253	CGC, nome ceppo: EJ1158		Genotipo: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Il laboratorio di Della David presso DZNE Tü bingen		Genotipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Il laboratorio di Della David presso DZNE Tü bingen		Genotipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]