Method Article

Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce la procedura sperimentale e informazioni su reagenti, attrezzature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di variazioni del numeri di copie in piante.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mutanti sono risorse inestimabili genetiche per gli studi di funzione del gene. Per generare collezioni mutante, tre tipi di agenti mutageni possono essere utilizzati, tra cui biologico come T-DNA o trasposoni, chimiche quali methanesulfonate etilico (EMS) o fisici come le radiazioni di ionizzazione. Il tipo di mutazione osservata varia a seconda del mutageno utilizzato. Per ionizzazione indotta da radiazioni mutanti, mutazioni includono l'eliminazione, la duplicazione o la riorganizzazione. Mentre è limitata alle specie che sono suscettibili di trasformazione T-DNA o basati su trasposone mutagenesi, mutagenesi chimica o fisica può essere applicata a una vasta gamma di specie. Tuttavia, la caratterizzazione delle mutazioni derivato da mutagenesi chimica o fisica tradizionalmente si basa su un approccio di clonazione sulla mappa, che è lavoro intensivo e richiede tempo. Qui, indichiamo che una piattaforma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) genoma ad alta densità può essere applicata per rilevare e caratterizzare le variazioni del numero di copia (CNV) in mutanti derivati da mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in efficacemente Medicago truncatula, una specie di legume. Analisi di sequenza del genoma intero dimostra che ci sono più di 50.000 geni o modelli di gene in M. truncatula. Mutanti presenti, FNB-indotta in M. truncatula sono derivati da più di 150.000 linee M1, che rappresentano preziose risorse genetiche per studi funzionali dei geni nel genoma. La piattaforma di aCGH descritta qui è un efficace strumento per la caratterizzazione di mutanti FNB-indotta in M. truncatula.

Introduction

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Leguminose (Fabaceae) sono la terza più grande famiglia di piante fiorite, con molte specie economicamente importanti come soia (Glycine max l.) e l'erba medica (Medicago sativa). Piante leguminose possono interagire con azoto-fissazione di batteri del suolo, generalmente chiamato Rhizobia a sviluppare noduli radice in cui il dinitrogen atmosferici sono ridotti ad ammoniaca per uso di pianta ospite. Come tale, coltivazione delle leguminose richiede poco input di fertilizzanti azotati e contribuisce così all'agricoltura sostenibile. Leguminose producono foglie e semi ad alto contenuto proteico, che funge da ottimo foraggio e cereali. Tuttavia, specie di legume coltivato hanno generalmente strutture complesso genoma, rendendo gli studi funzionali di geni che svolgono un ruolo chiave nei processi specifici del legume ingombranti. Medicago truncatula è stato ampiamente adottato come una specie di modello per studi di legume, principalmente perché (1) ha un genoma diploide con una dimensione relativamente piccola del genoma aploide (~ 550 Mbp); (2) piante possono essere trasformate stabilmente per studi funzionali del gene; e (3) si è collegato strettamente a erba medica (M. sativa), la Regina dei foraggi e molte altre colture economicamente importante per studi traslazionali. Recentemente, la sequenza del genoma di M. truncatula cv Jemalong A17 è stato rilasciato1,2. Annotazione del genoma Mostra che ci sono più di 50.000 geni predetti o modelli di gene nel genoma. Per determinare la funzione della maggior parte dei geni in M. truncatula genoma è un compito impegnativo. Per facilitare gli studi funzionali dei geni, una vasta collezione di mutanti nella gamma di oltre 150.000 M1 linee è stata generata utilizzando mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutroni veloci, un mutageno di ionizzazione ad alta energia, sono stato utilizzato nella generazione di mutanti in molte specie di piante tra cui Arabidopsis5,6, riso (Oryza sativa)7, pomodoro (Solanum lycopersicum), soia (Glycine soja; G. max)8,9, orzo (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Una grande parte delle mutazioni derivato da mutagenesi FNB sono a causa di omissioni del DNA che variano in dimensioni da poche coppie di basi a mega paia di basi9,11. Molti geni associati al fenotipo sono stati correttamente identificato e caratterizzato4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. in precedenza, clonazione molecolare dei geni sottostanti da mutanti FNB invocata da un approccio basato su mappa, che richiede tempo e limita il numero di mutanti per essere caratterizzata a livello molecolare. Recentemente, diversi approcci gratuiti inclusi metodi basati sulla trascrizione, genoma affiancamento ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice per la rilevazione del DNA copia numero variazione e sequenziamento del genoma intero, è stato impiegato per facilitare il caratterizzazione di mutanti di delezione in diversi organismi, tra cui animali e piante20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Per facilitare la caratterizzazione di mutanti FNB in M. truncatula, un intero genoma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) piattaforma è stato sviluppato e convalidato. Come riportato in sistemi animali, la piattaforma CGH array-based permette la rilevazione di variazioni del numeri di copie (CNV) a livello di intero genoma nei mutanti di M. truncatula FNB. Inoltre, le lesioni possono essere confermate mediante PCR e bordi di eliminazione possono essere identificati mediante sequenziamento. Nel complesso, la piattaforma CGH array è uno strumento efficiente ed efficace nell'identificazione delle lesioni nei mutanti di M. truncatula FNB. Qui, la procedura CGH array e la caratterizzazione di PCR delle frontiere di eliminazione in un mutante di M. truncatula FNB sono illustrati.

Il seguente protocollo vengono fornite procedure sperimentali e informazioni su reagenti, apparecchiature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di numero di copia variazioni nelle piante. Ad esempio, Medicago truncatula FN6191 mutante è stato utilizzato per identificare regioni di eliminazione e geni candidati associati con fenotipi mutanti. M. truncatula FN6191 mutante, originariamente isolato da un neutrone veloce eliminazione indotta da bombardamento mutante collezione32 (Vedi Tabella materiali), hanno esibito un fenotipo iper-nodulazione dopo l'inoculazione con il terreno batterio, meliloti Sihorhizobium Sm1021, in contrasto con piante di tipo selvaggio.

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Protocol

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Nota: la figura 1 Mostra i cinque passi per il protocollo CGH array. Essi sono: 1) preparazione di materiali vegetali; 2) isolamento di campioni di DNA di alta qualità; 3) etichettatura e purificazione di campioni di DNA; 4) ibridazione, lavaggio e la scansione di matrici intero genoma; e 5) analisi dei dati CGH. M. truncatula intero genoma piastrellatura matrici contengono un totale di 971.041 sonde oligo unico targeting più di 50.000 geni o modelli di gene nel genoma (Vedi tabella materiali). Le sonde uniche sono spaziate circa ogni 150 paia di basi (bp) in regioni exonic e 261 bp in regioni introniche del genoma di M. truncatula.

1. preparazione di materiali vegetali

  1. sacrifici wild type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) e semi mutanti di FN6191 con acido solforico concentrato per 8 min (Vedi Tabella materiali). Rimuovere e smaltire l'acido solforico per un contenitore per rifiuti liquidi.
  2. Sciacquare i semi con acqua deionizzata in autoclave tre volte.
  3. Superficie sterilizzare semi con soluzione di candeggina al 20% per 10 min.
  4. Sciacquare i semi con acqua deionizzata in autoclave tre volte.
  5. Semi di store a 4 ° C per 3 giorni. Dopo la vernalizzazione, trasferimento e far germinare i semi nel terreno per una settimana in una camera di crescita con 16 h/8 h ciclo luce/buio e 150 µE/m 2/s l'intensità della luce.
  6. Trapiantare le piantine a 1 gallone pentole e farle crescere in una serra con ciclo luce/buio di 16 h/8 h, 150 µE/m/s 2 intensità luminosa per tre o quattro settimane. Raccogliere campioni di foglia giovane dalle piante per isolamento del DNA.

2. Isolamento di alta qualità campioni di DNA

  1. prendere 1 g di tessuto fogliare giovane da una singola pianta e congelare in azoto liquido immediatamente.
  2. Macinare tessuto fogliare congelati in azoto liquido con un mortaio e pestello per polvere fine.
  3. Isolare DNA genomico con un isolamento di DNA kit (Vedi Tabella materiali).
  4. Risospendere purificato campioni di DNA in 50 µ l di sterilizzato nell'autoclave doppia deionizzata H 2 O (ddH 2 O) o 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Concentrazioni nel DNA di misura con uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
  6. Valutare 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm rapporti di campioni di DNA.
    Nota: I campioni di DNA di alta qualità dovrebbero avere un rapporto di 260 nm/280 nm ≥ 1.8 e un rapporto di 260 nm/230 nm ≥ 2.0.
  7. Ulteriormente valutare campioni di DNA mediante l'esecuzione in 1% gel dell'agarosi.
    Nota: I campioni di DNA di alta qualità dovrebbero avere ad alto peso molecolare e non dovrebbero essere contaminati da RNA. Idealmente, la concentrazione finale di campioni di DNA dovrebbe essere ~ 150 ng / µ l.

3. Etichettatura di DNA e purificazione

  1. diluire 1 µ g di DNA genomic campioni con ddH 2 O ad un volume finale di 20 µ l in una provetta da centrifuga 500 µ l.
  2. Aggiungere 5 µ l di primer casuale (Vedi Tabella materiali) per il tubo.
  3. Vortex brevemente il tubo e metterlo in un termociclatore per incubare e denaturazione del DNA a 98 ° C per 10 min.
  4. Prendere il tubo fuori il termociclatore e metterla immediatamente in acqua con ghiaccio per raffreddare per 5 min.
  5. Preparare due etichettatura mescola come mostrato in tabella 1.
  6. Tubi di aggiungere 25 µ l di mix 1 e 2 di riferimento DNA e DNA campione di etichettatura, rispettivamente.
  7. Mescolare la miscela e il DNA d'etichettatura pipettando tre volte e girare i tubi brevemente.
  8. Mettere le provette in un termociclatore per incubare a 37 ° C per 2 h e quindi a 65 ° C per 20 min inattivare l'enzima exo-Klenow (Vedi Tabella materiali).
  9. µ L di aggiungere 430 di 1x buffer di TE in ogni provetta.
  10. Mescolare il contenuto e girare i tubi brevemente.
  11. Trasferimento della soluzione nel tubo in una colonna di purificazione con una collezione di 2 mL tubo (vedere Tabella materiali).
  12. Centrifuga della colonna di purificazione a 14.000 x g per 10 min.
  13. Scartare il pass-through soluzione.
  14. Aggiungere 480 µ l 1 x buffer di TE per ogni colonna.
  15. Centrifuga della colonna nuovamente a 14.000 x g per 10 min.
  16. Scartare la soluzione pass-through.
  17. Trasferire il campione di DNA con etichettato che rimane nella parte inferiore della colonna a una nuova centrifuga.
  18. Misurare il volume del campione di DNA con etichettato utilizzando una pipetta e portare il volume finale di 80 µ l con 1x TE.
  19. Misurare la concentrazione del campione del DNA con etichetta utilizzando uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).
  20. Mescolare una pari quantità di campione con etichetta DNA e DNA di riferimento e portare il volume finale a 160 µ l con TE 1x.
  21. Aggiungere 256 µ l di tampone di ibridazione, 50 µ l di DNA umano Cot-1 e 50 µ l di 10 × aCGH agente bloccante: 2x (Vedi Tabella materiali) e mescolarli bene pipettando per tre volte.
  22. Girare i tubi brevemente e metterli in un termociclatore per incubare a 98 ° C per 10 min.
  23. Incubare le provette a 37 ° C per 20 min.

4. Ibridazione, lavatrice e scansione delle matrici genoma

  1. pre-riscaldare il forno di ibridazione a 67 ° C almeno 4 h prima dell'avvio di ibridazione.
  2. Disporre un vetrino di guarnizione sulla base di una camera di ibridazione.
  3. Carico 490 µ l di soluzione di ibridazione 3,23 passo sulla diapositiva guarnizione.
  4. Coprire la diapositiva di guarnizione con un chip di microarray del genoma di Medicago truncatula per formare una camera di ibridazione.
  5. Mettere sulle copertine di camera di ibridazione e serrare saldamente la camera con morsetti.
  6. Mettere la camera di ibridazione assemblato nel forno ibridazione e incubare a 67 ° C per 40-48 h.
  7. Scivolo di preparare tre piatti di lavaggio: due con 250 mL di tampone di lavaggio ho mantenuto a temperatura ambiente, ed uno con lavatrice buffer II mantenuta a 37 ° C.
  8. Scivolo di preparare due vasetti di lavaggio: uno con 70 mL acetonitrile e uno con 70 mL stabilizzazione e asciugatura soluzione; tenere entrambi in una cappa a temperatura ambiente (Vedi Tabella materiali).
  9. La camera di ibridazione di togliere dal forno e rimuovere i morsetti di camera e copertura.
  10. Spostare il chip di microarray e la guarnizione scivolare per un piatto di lavaggio diapositiva con tampone di lavaggio io e separare il chip dalla diapositiva coperchio.
  11. Mossa microarray del chip per il lavaggio di diapositiva secondo piatto con tampone di lavaggio ho e delicatamente far circolare la soluzione con un ancoretta su una piastra magnetica a temperatura ambiente per 5 min.
  12. Trasferimento microarray del chip per la terza diapositiva lava piatto con tampone di lavaggio pre-riscaldato II e lavarla delicatamente con un ancoretta su una piastra magnetica a 37 ° C per 1 min.
  13. Trasferire il chip di microarray a una diapositiva vaso con acetonitrile in una cappa di lavaggio e lavarlo per 30 s.
  14. Trasferire il chip di microarray a una diapositiva vaso con stabilizzazione di lavaggio e asciugatura soluzione e lavarlo per 30 s.
  15. Togliere lentamente il chip e asciugare per 1 min.
  16. Scan il chip di microarray utilizzando uno scanner (Vedi Tabella materiali) sotto i 2 µm ad alta risoluzione. Impostare i parametri per salvare più immagini e scansioni di intera diapositiva. Impostare i canali 1 e 2 guadagni al 100% e annullare il guadagno automatico.

5. Analisi dei dati CGH

  1. estratto la fluorescenza Cy3 e Cy5 intensità per ogni sonda sull'array utilizzando software di scansione (vedere Tabella materiali).
  2. Analisi di segmentazione di uso del software per rilevare variazioni numeri di copie (CNV) tra il campione DNA e DNA di riferimento. Utilizzare una soglia di segmento log medio 2 campione/riferimento rapporto ± 2,5 deviazioni standard per la determinazione CNVs.
  3. Controllare la distribuzione di rapporti del campione/riferimento di registro 2 attraverso l'intero genoma utilizzando un software di mappatura del segnale (Vedi Tabella materiali).

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Results

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La figura 2 Mostra la distribuzione dei rapporti di2 ceppo normalizzato del mutante rispetto al WT segnali attraverso l'intero genoma. L'analisi dei dati CGH ha rivelato un approssimativo annotato 22 kb omissione sul cromosoma 4 che racchiude l'intero gene SUNN 33 e parecchi altri geni in mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). La regione cancellata candidato ...

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Discussion

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Abbiamo sviluppato una piattaforma CGH array-based per la rilevazione e la caratterizzazione di bombardamento di neutroni veloci (FNB)-indotta di mutanti di M. truncatula CV Jemalong A17. Per illustrare l'utilizzo della matrice metodo CGH nella rilevazione di mutazioni del gene, abbiamo effettuato l'analisi di aCGH del mutante FN6191, che ha esibito un fenotipo iper-nodulazione in contrasto con piante di tipo selvaggio, quando inoculati con S. meliloti Sm1021. Per le analisi di segmentazione, un segment...

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

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Finanziamento di questo lavoro è fornito in parte da una sovvenzione da NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula matrice del genoma, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutante)In casaFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (riferimento)In casaA17
Acido solforicoSigma-Aldrich320501
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104
Spettrofotometro NanodropThermo Scientific1000D
SureTag Kit di Marcatura DNAAgilent5190-3400
Primer casualeAgilent5190-3399
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-1L
TermociclatoreMJ researchPTC-200
CentrifugaLabnet international IncSpectrafuge 24D
Soluzione di stabilizzazione ed essiccazioneAgilent5185-5979
Kit di ibridazione Oligo aCGH/ChIP-on-chipAgilent5188-5380
Vetrini per guarnizioni della camera di ibridazioneAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Tampone di lavaggio Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 e 2Agilent5188-5221
, acciaio inossidabileAgilentG2534A
Forno di ibridazione Colonne di purificazioneAgilentG2545A
Scanner laser Agilent5190-3391
RocheMS200
NimbleScan 2.6Roche Nimblegen5225035001
Mappa del segnale 1.9Roche NimblegenSignalmap1.9
Camera di ibridazione

References

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