Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Summary

Questo protocollo fornisce la procedura sperimentale e informazioni su reagenti, attrezzature e strumenti di analisi per i ricercatori che sono interessati a effettuare analisi di ibridazione genomica comparativa (CGH) matrice di intero genoma di variazioni del numeri di copie in piante.

Abstract

I mutanti sono risorse inestimabili genetiche per gli studi di funzione del gene. Per generare collezioni mutante, tre tipi di agenti mutageni possono essere utilizzati, tra cui biologico come T-DNA o trasposoni, chimiche quali methanesulfonate etilico (EMS) o fisici come le radiazioni di ionizzazione. Il tipo di mutazione osservata varia a seconda del mutageno utilizzato. Per ionizzazione indotta da radiazioni mutanti, mutazioni includono l'eliminazione, la duplicazione o la riorganizzazione. Mentre è limitata alle specie che sono suscettibili di trasformazione T-DNA o basati su trasposone mutagenesi, mutagenesi chimica o fisica può essere applicata a una vasta gamma di specie. Tuttavia, la caratterizzazione delle mutazioni derivato da mutagenesi chimica o fisica tradizionalmente si basa su un approccio di clonazione sulla mappa, che è lavoro intensivo e richiede tempo. Qui, indichiamo che una piattaforma basata su array ibridazione genomica comparativa (CGH) genoma ad alta densità può essere applicata per rilevare e caratterizzare le variazioni del numero di copia (CNV) in mutanti derivati da mutagenesi di bombardamento (FNB) di neutroni veloci in efficacemente Medicago truncatula, una specie di legume. Analisi di sequenza del genoma intero dimostra che ci sono più di 50.000 geni o modelli di gene in M. truncatula. Mutanti presenti, FNB-indotta in M. truncatula sono derivati da più di 150.000 linee M1, che rappresentano preziose risorse genetiche per studi funzionali dei geni nel genoma. La piattaforma di aCGH descritta qui è un efficace strumento per la caratterizzazione di mutanti FNB-indotta in M. truncatula.

Introduction

Leguminose (Fabaceae) sono la terza più grande famiglia di piante fiorite, con molte specie economicamente importanti come soia (Glycine max l.) e l'erba medica (Medicago sativa). Piante leguminose possono interagire con azoto-fissazione di batteri del suolo, generalmente chiamato Rhizobia a sviluppare noduli radice in cui il dinitrogen atmosferici sono ridotti ad ammoniaca per uso di pianta ospite. Come tale, coltivazione delle leguminose richiede poco input di fertilizzanti azotati e contribuisce così all'agricoltura sostenibile. Leguminose producono foglie e semi ad alto contenuto proteico, che funge da ottimo foraggio e cereali.....

Protocol

Nota: la figura 1 Mostra i cinque passi per il protocollo CGH array. Essi sono: 1) preparazione di materiali vegetali; 2) isolamento di campioni di DNA di alta qualità; 3) etichettatura e purificazione di campioni di DNA; 4) ibridazione, lavaggio e la scansione di matrici intero genoma; e 5) analisi dei dati CGH. M. truncatula intero genoma piastrellatura matrici contengono un totale di 971.041 sonde oligo unico targeting più di 50.000 geni o modelli di gene nel genoma (Vedi tabella materiali). Le sonde uniche sono spaziate circa ogni 150 paia di basi (bp) in regioni exonic e 261 bp in regioni introniche del ge....

Results

La figura 2 Mostra la distribuzione dei rapporti di₂ ceppo normalizzato del mutante rispetto al WT segnali attraverso l'intero genoma. L'analisi dei dati CGH ha rivelato un approssimativo annotato 22 kb omissione sul cromosoma 4 che racchiude l'intero gene SUNN ³³ e parecchi altri geni in mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). La regione cancellata candidato .......

Discussion

Abbiamo sviluppato una piattaforma CGH array-based per la rilevazione e la caratterizzazione di bombardamento di neutroni veloci (FNB)-indotta di mutanti di M. truncatula CV Jemalong A17. Per illustrare l'utilizzo della matrice metodo CGH nella rilevazione di mutazioni del gene, abbiamo effettuato l'analisi di aCGH del mutante FN6191, che ha esibito un fenotipo iper-nodulazione in contrasto con piante di tipo selvaggio, quando inoculati con S. meliloti Sm1021. Per le analisi di segmentazione, un segment.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula matrice del genoma, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutante)	In casa	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (riferimento)	In casa	A17
Acido solforico	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Spettrofotometro Nanodrop	Thermo Scientific	1000D
SureTag Kit di Marcatura DNA	Agilent	5190-3400
Primer casuale	Agilent	5190-3399
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-1L
Termociclatore	MJ research	PTC-200
Centrifuga	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Soluzione di stabilizzazione ed essiccazione	Agilent	5185-5979
Kit di ibridazione Oligo aCGH/ChIP-on-chip	Agilent	5188-5380
Vetrini per guarnizioni della camera di ibridazione	Agilent	G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Tampone di lavaggio Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 e 2	Agilent	5188-5221
, acciaio inossidabile	Agilent	G2534A
Forno di ibridazione Colonne di purificazione	Agilent	G2545A
	Scanner laser Agilent	5190-3391
	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Nimblegen	5225035001
Mappa del segnale 1.9	Roche Nimblegen	Signalmap1.9