Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Sommario

Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.

Abstract

Gli esosomi sono vescicole extracellulari nanometriche secernute dai fluidi corporei e sono conosciuti per rappresentare le caratteristiche di cellule che secernono i loro. Il contenuto e la morfologia delle vescicole secrete riflettono comportamento delle cellule o stato fisiologico, ad esempio la crescita delle cellule, migrazione, scissione e la morte. Ruolo degli esosomi può altamente dipende dalla dimensione e la dimensione degli esosomi varia da 30 a 300 nm. Il metodo più ampiamente usato per l'imaging di esosomi è macchiatura negativa, mentre altri risultati si basano su microscopia elettronica di Cryo-trasmissione, microscopia a scansione e microscopia a forza atomica. Morfologia di esosomi tipici valutato tramite colorazione negativa è a forma di Coppa, ma ulteriori dettagli non sono ancora chiari. Un esosomi ben caratterizzati attraverso studio strutturale sono necessaria particolare in campo medico e farmaceutico. Di conseguenza, funzione dipendente dalla morfologia deve essere verificata mediante tecniche di microscopia elettronica quali etichettatura una proteina specifica in struttura dettagliata di esosomi. Per osservare la struttura dettagliata, sono state confrontate ultrasottile immagini sezionate e immagini negative macchiate di esosomi. In questo protocollo, consigliamo di microscopia elettronica di trasmissione per l'imaging di esosomi incluse macchiatura negativa intero Monte immunocolorazione, preparazione di blocco, sezione sottile ed etichettatura immuno-oro.

Introduzione

Vescicole extracellulari (EVs) sono vescicole di bilayer del lipido secernute dalle cellule e loro dimensione varia tra 30 e 300 nm. SVE in primo luogo sono stati segnalati nel 1978, con evidenza dalle vescicole di pazienti con malattia di Hodgkin¹. Queste vescicole sono state segnalate per essere 40 a 120 nanometri di dimensione. Nel 1980, è stato riferito che SVE sono coinvolti nel sistema di coagulazione e trombosi, formazione di un coagulo di sangue all'interno di un vaso sanguigno nel cancro pazienti². Dopo 30 anni, EVs sono stati segnalati per essere un fattore importante per promuovere l'invasione del tumore, fuga....

Protocollo

1. blocco preparazione, taglio, colorazione e di Imaging dell'esosomi

1. Pallina gli esosomi da supernatante di coltura delle cellule HCT116 mediante centrifugazione a 100.000 x g per 1,5 h²³. Rimuovere il surnatante della cultura e fissare attentamente il pellet di esosomi purificata con 1 mL di 2,5% glutaraldeide in soluzione di cacodilato di sodio 0.1 M (pH 7.0) per 1 h a 4 ° C. Per 0.1 M sodio cacodilato, sciogliere l'acido cacodilico 4,28 g in 160 mL di acqua distillata (DW). Regolare il pH a 7.4 con 0.1 M HCl quindi apportare fino a 200 mL con acqua distillata.
2. Rimuovere il fissativo e sciacquare i pellet con 1 mL di ta....

Risultati

Attualmente, gli esosomi sono classificati in categorie di forma e dimensioni da microscopia elettronica di trasmissione. La figura 2 Mostra negativo macchiato esosomi e immunitario-etichettati esosomi intero supporto dello stato. La figura 3 Mostra sezionato esosomi e immuno-etichettati esosomi dopo taglio sottile. Immuno-oro che macchia usando gli anticorpi di specifiche proteine viene utilizzato positivamente un esosomi di ide.......

Discussione

Questo articolo presenta un protocollo per osservare la struttura di esosomi dettagliate e l'etichettatura delle sue proteine specifiche. Macchiatura negativa è stata considerata come il miglior metodo per esosomi¹⁷di imaging. Questa tecnica convenzionale ha mostrato la struttura a forma di Coppa degli esosomi. Tuttavia, questa forma di Coppa è una forma di manufatto che può verificarsi a causa del processo di essiccazione. Cryo-TEM risultati hanno mostrato che gli esosomi hanno una struttura perf.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glutaraldeide	EMS	16200
Cacodilato di sodio	EMS	12300
Tetrossido di osmio 1 g di cristallo	EMS	19100	Utilizzare solo in cappa aspirante
acetone	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-microtomo	Leica	UCT
Acetato di uranile	EMS	22400	Sostanza chimica pericolosa
Citrato di piombo	EMS	17900
Microscopia elettronica a trasmissione	Hitachi	H7600
griglia di nichel	EMS	G200-Ni
Griglia di rame	EMS	G200-Cu
glicina	SIGMA	022K5404
Soluzione salina tampone fosfato	SIGMA	P4417
Albumina sierica bovina	Aurion	25557
1° Purificazione degli anticorpi			in manuale
Anticorpo CD274 (B7-H1, PD-L1) anti-umano purificato	BioLegend	329710	Immumogold a montatura intera
, κ Isotipo Ctrl	BioLegend	401202	Montatura intera Immumogold (Controllo)
2° Anti-topo igG coniugato 9-11 nm particella d'oro	sigma	G7652
Microscopia elettronica a trasmissione	JEOL	JEM2200FS
Scaricatore di bagliore	JEOL	JFC1100E
Griglia di carbonio	EMS	121119
Paraformaldeide	EMS	19210
Griglia in rame rivestita in carbonio Formvar (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar rivestita in carbonio  Griglia in nichel (200 mesh)	EMS	FCF200-NI

IgG2b di topo purificato