Articolo metodologico

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 settembre 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.

Abstract

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L'obesità materna è associata con un rischio aumentato di esiti perinatali negativi che sono probabilmente mediati da compromissione della funzione placentare che può essere attribuito, in parte, la disregolazione dell'autofagia. Aberrante cambiamenti nell'espressione di regolatori dell'autofagia in placente da gravidanze obese possono essere regolati tramite i processi infiammatori connessi con l'obesità e la gravidanza. Un protocollo per il campionamento del tessuto villous e isolamento di cytotrophoblasts dei villi della placenta umana a termine per colture cellulari primarie è descritto qui. Questa è seguita da un metodo per simulare il milieu infiammatorio nell'ambiente intrauterino obeso trattando trofoblasti primari da magre gravidanze con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), una citochina proinflammatory che è elevata nell'obesità e nella gravidanza. Attraverso l'implementazione del protocollo descritto qui, è trovato che l'esposizione a esogeno TNFα regola l'espressione di Rubicon, un regolatore negativo dell'autofagia, nel trofoblasto da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Mentre una varietà di fattori biologici nell'ambiente intrauterino obeso mantenere il potenziale di modulare le vie critiche nel trofoblasto, questo sistema ex vivo è particolarmente utile per determinare se espressione modelli osservata in vivo in placente umane con l'obesità materna sono un risultato diretto di TNFα segnalazione. In definitiva, questo approccio offre l'opportunità di analizzare le implicazioni normative e molecolare di infiammazione associata con l'obesità materna su autophagy e su altre vie cellulari critici nel trofoblasto che hanno il potenziale di impatto funzione placentare.

Introduzione

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L'obesità è uno stato infiammatorio caratterizzato da infiammazione cronica, derivante dal tessuto adiposo in eccesso e disponibilità di nutrienti. Nell'obesità, citochine proinfiammatorie sono elevate nei tessuti metabolici così come sistematicamente in circolazione. Un robusto corpo di prova ha dimostrato che TNFα è significativamente elevato nella regolazione dell'obesità con implicazioni in insulino-resistenza e disfunzione metabolica1. Attivazione di TNFα contribuisce alla patogenesi della malattia in condizioni come il cancro e l'autoimmunità, che lo rende un obiettivo terapeutico attraente2.

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Protocollo

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placente sono stati raccolti dall'unità di consegna all'ospedale universitario e del lavoro nell'ambito di un protocollo approvato dall'istituzionale Review Board of Oregon Health and Science University a Portland, Oregon, con il consenso informato il pazienti.

1. raccolta di tessuto placentare

  1. preparazione
    Nota: tutte le attrezzature che incontra il tessuto devono essere sterile.
    1. L'apparecchiatura per dissezione di sterilizzare in autoclave per 60 min a 121 ° C.
    2. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE): laboratorio cappotti/abiti/scrub, guanti e maschera con una visiera o....

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Risultati

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Termine le placente umane dal magro (pre-gravidanza massa corporea (BMI) < 25) le madri con gravidanze semplici che trasportano prole femminile sono stati raccolti e campionate entro 15 minuti di consegna dalla sezione cesarean (non lavoro). Le placente sono state esaminate per l'assenza di calcificazioni e sviluppo tipico: peso compreso tra 300-600 g con il cordone ombelicale e membrane rimosse, rotondo in forma, tra 15-25 cm di diametro e inserito nel mezzo del cordone ombelicale la .......

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Discussione

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La placenta, responsabile della regolazione della crescita del feto, esibisce funzione compromessa in obesi ambiente6. Nonostante le elevate esigenze metaboliche di trofoblasto, placente con l'obesità materna esibiscono disfunzionali respirazione mitocondriale6,19. Cambiamenti nel metabolismo placenta possono contribuire all'aumento di incidenza di complicanze e i risultati fetali avversi osservati in gravidanze obesi3

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano le donne che hanno donato loro placente per questo studio. Ringraziamo anche il dipartimento di consegna al OHSU e materno e fetale Team di ricerca e lavoro per coordinare la raccolta di placente. Siamo grati a Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD per supporto e aiuto con metodi sperimentali e ottimizzazione.

Questo lavoro è stato finanziato da NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (anhyd.)Sigma-AldrichC1016-100G
MgSO4 (anid.)Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TripsinaGibco15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.
Inibitori della proteasi/fosfatasiThermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
Sodio desossicolato.Fisher Scientific AAJ6228822
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM)Gibco12440-046
Siero fetale bovino (FBS)Corning35-010-CV
Siero neonatale per vitelli (NCS)Gibco26010-074
Penicillina/Streptomicina (Pen/Streptomica)Gibco15140-122
10% formalinaFisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNF&alfa;Sigma-AldrichSRP3177-50UG
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco70013-032
K2EDTA Provette per prelievo di sangue vacutainerBD366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)GE Healthcare17-0891-01
Piastre a 6 pozzettiCorning353046
Filtri cellulariFisher Scientific22363549
Eppendorf Provette Safe-Lock 2,0 mL, naturaliFisher Scientific22363352
Trypan BlueCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot CellBio-Rad1658033
TGX FastCast Acrilammide Kit, 12% Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 Camera di Multi-ColataBio-Rad1654112
4X Laemmli Tampone per campioniBio-Rad1610747
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM3148-100ML
GlicinaBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
Latte secco scremato istantaneoGarofano
Rubicon (D9F7) Tecnologiadi segnalazione cellulare8465S
Anticorpo monoclonale anti-β-actina prodotto nel topoSigma-AldrichA2228-100UL
Anti-coniglio IgG, tecnologiadi segnalazione cellulare7074S
IgG anti-topo, anticorpolegato a HRPTecnologia di segnalazione cellulare7076S
SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescenteThermo Scientific34578
LS002139 mAb di coniglio anticorpo legata a HRP

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M.

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Isolamento del trofoblastocampionamento del tessuto villosotrattamento con TNF alfacoltura cellulare primariaWestern blottinganalisi immunocitochimicacentrifugazione a gradiente di densitespressione di Rubiconmodello di obesit maternaregolazione dell autofagia

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