Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l'infezione di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.
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Articolo metodologico
Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fibre elettrofilate (EFs) sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di applicazioni terapeutiche; Tuttavia, solo recentemente sono stati applicati come una tecnologia per prevenire e curare sessualmente trasmissibili (malattie sessualmente trasmissibili). Inoltre, molte tecnologie di EF concentrano sull'incapsulamento l'agente attivo, rispetto che utilizzano la superficie per impartire biofunzionalità. Qui descriviamo un metodo per fabbricare e superficie-modificare le fibre elettrofilate (PLGA) acidi poly(lactic-co-glycolic), con il potente antivirale lectin Griffithsin (GRFT). PLGA è un polimero approvato dalla FDA che è stato ampiamente utilizzato nella somministrazione di farmaci a causa di sue eccezionali proprietà chimiche e biocompatibile. GRFT è un naturale, potente, sicuro lectin che possiede vasta attività contro numerosi virus compreso il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Quando combinati, GRFT-modificato fibre hanno dimostrato potente inattivazione di HIV-1 in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e caratterizzare GRFT-modificato EFs. In primo luogo, PLGA è elettrofilate per creare un'impalcatura di fibra. Le fibre sono successivamente modificate in superficie con GRFT utilizzando 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide (EDC) e N-Idrossisuccinimide (NHS) chimica. Microscopia elettronica (SEM) è stato utilizzato per valutare la dimensione e la morfologia delle formulazioni modificate in superficie. Inoltre, un gp120 o emoagglutinina (HA)-ELISA base può essere usato per quantificare la quantità di GRFT coniugato a, come pure il desorbimento GRFT dalla superficie della fibra. Questo protocollo può essere applicato più ampiamente per fabbricare fibre che vengono modificate in superficie con una varietà di differenti proteine.
Introduzione
L'utilizzo di EFs come una piattaforma di consegna attuale ha il potenziale per ridurre in modo significativo le malattie sessualmente trasmissibili. Attualmente, ci sono oltre 36 milioni persone affette da HIV, con oltre 2 milioni di nuovi casi segnalati nel 2015 solo1,2. Inoltre, virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infezione colpisce centinaia di milioni di persone in tutto il mondo e ha dimostrato di migliorare l'acquisizione dell'HIV da 2-5 volte3. A causa di questa relazione tra infezione HSV-2 e acquisizione di HIV, c'è notevole interesse nello sviluppo di nuovi agenti attivi che ....
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Protocollo
1. preparazione e montaggio dell'impalcatura di fibre elettrofilate
Attenzione: tutti i lavori con solventi o soluzioni di polimero devono essere eseguiti in una cappa chimica . Vedere la scheda tecnica di sicurezza materiale di ciascun reagente prima di iniziare il protocollo.
- a electrospin una soluzione di polimero di 3 mL 15% w/w PLGA, pesare 720 mg di 50: 50 poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) in un flacone da 10 mL di scintillazione. Il volume della soluzione si basa sui vostri lotti tipici utilizzati negli studi attuali.
Nota: La massa di polimero per aggiungere a un determin....
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Risultati
Morfologia delle fibre ha un effetto significativo sulla capacità di modificazione superficiale EFs per fornire protezione contro i virus. Anche se elettrofilatura è una procedura semplice e conveniente, formulazioni polimeriche non ottimizzato possono provocare la morfologia delle fibre irregolari (Figura 5B-C). Alterazioni in condizioni di elettrofilatura che risultano nella formazione di morfologie di mat-come perline o amorfe, sono spesso.......
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Discussione
Grazie alle strutture porose e grandi superfici, EFs hanno trovato una varietà di applicazioni nel settore sanitario, uno dei quali comprende che serve come veicoli di consegna terapeutico. Farmaci e altri agenti attivi possono essere incorporati all'interno di EFs per consegna sintonizzabile, mentre biologics e leganti chimici possono essere coniugati alla superficie della fibra per cellula-specifico targeting52 o biosensoristica53. Qui la fabbricazione di GRFT modificate .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati al fondo patrimonio ebraico per eccellenza per la ricerca di finanziamenti. Ringraziamo il Dr. Stuart Williams II per generosamente fornendo l'utilizzo del sistema di elettrofilatura. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Palmer per averci fornito con Griffithsin. Ringraziamo inoltre Dr. Nobuyuki Matoba e suo laboratorio per la formazione di che noi nell'ELISA GRFT lavorare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Poli(lattide-co-glicolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) | Thermo Scientific | ||
| Ago per l'erogazione smussato 18g x 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD Siringa da 3 ml Punta Luer-lok | VWR | 309657 | |
| Parafilm (film plastico) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-Morpholino)Acido etansolfonico (tampone MES) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Idrossisuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| cloridrato di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | su misura, nessun numero di prodotto |
| Dimetil solfossido | Milipore | 317275 | |
| Polietilenglicole sorbitano monolaurato (Polisorbato, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Piastre Immuno Non Sterili a 96 Pozzetti a Fondo Piatto | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Emoagglutinina (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | su misura, nessun codice prodotto |
| Capra Anti-GRFT (anticorpo primario) | Kentucky Bioprocessing | NA | su misura, nessun codice prodotto |
| Coniglio anti-capra IgG-HRP (anticorpo secondario) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Perossidasi Substrato | KPL | 52-00-00 |
Riferimenti
- Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
- Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
- Freeman, E. E., et al.
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Ristampe e permessi
Tag
Fabbricazione di fibre elettrofilateelettrofilatura di PLGAchimica della modifica superficialeinattivazione di HIV-1 tramite Griffithsinanalisi tramite microscopia elettronica a scansionequantificazione proteica tramite ELISAconiugazione EDC-NHScaratterizzazione della morfologia delle fibrerilascio di farmaci antivirali
