Articolo metodologico

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 novembre 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Processi cellulari di base come replicazione del DNA e segregazione, sintesi proteica, biosintesi della parete cellulare e divisione cellulare si affidano la funzione delle proteine che sono essenziali per la sopravvivenza batterica. Una serie di coloranti specifici per la destinazione può essere utilizzata come sonde per meglio comprendere questi processi. Colorazione con coloranti lipofilici permette l'osservazione della struttura della membrana, visualizzazione di microdomini lipidici e la rilevazione delle vescichette di membrana. Utilizzo di fluorescente-d-amminoacidi (FDAAs) per sondare i siti della biosintesi del peptidoglicano possa indicare potenziali difetti nella biogenesi della parete cellulare o il modello di crescita delle cellule. Infine, le macchie di acido nucleico possono indicare eventuali difetti nella segregazione del cromosoma o replica di DNA. Cianina DNA macchie etichetta cellule viventi e sono adatto per microscopia time-lapse consentendo osservazioni in tempo reale della morfologia nucleoide durante la crescita delle cellule. Protocolli per l'etichettatura di cella possono essere applicati ai mutanti di deplezione di proteine per identificare i difetti nella struttura della membrana, biogenesi della parete cellulare o segregazione del cromosoma. Inoltre, microscopia time-lapse può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti morfologici come una proteina essenziale viene rimosso e può fornire ulteriori approfondimenti in funzione della proteina. Ad esempio, l'esaurimento delle proteine essenziali divisione cellulare provoca filamentazione o diramazione, considerando che l'esaurimento delle proteine della crescita delle cellule può causare le cellule a diventare più brevi o più rotondo. Qui, protocolli per la crescita delle cellule, l'etichettatura specifica della destinazione e microscopia time-lapse sono forniti per l'agente patogeno batterico pianta Agrobacterium tumefaciens. Insieme, target-specifici coloranti e time-lapse microscopia consentono la caratterizzazione dei processi essenziali in a. tumefaciens. Infine, i protocolli forniti possono essere facilmente modificati per sondare i processi essenziali in altri batteri.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progressione attraverso il ciclo cellulare batterica richiede il coordinamento di molti processi tra cui biosintesi membrana e parete cellulare, replicazione del DNA e la segregazione e la divisione cellulare. Per comprendere appieno la complessità della biologia della cellula batterica, è necessario studiare questi eventi essenziali; Tuttavia, questo è un compito banale, poiché la vitalità cellulare è compromessa quando componenti chiave di queste vie sono mutagenizzati. Epifluorescenza accoppiato con coloranti specifici per la destinazione è un approccio potente per sondare questi processi essenziali in wildtype e ceppi batterici mutanti.

Peptidoglicano specifici coloranti sono fluorescenti antibiotici (vancomicina-FL, bocillin-FL) e fluorescenti-ammino acidi (ad esempio, 7-hydroxycoumarin-3-carbossilico acido 3-ammino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetrametilrodamina-3-ammino-d-alanina; TADA). Nei batteri Gram-positivi, l'uso di concentrazioni subletali di antibiotici fluorescente analoghi ai siti della biosintesi del peptidoglicano della sonda è stato una strategia efficace per rivelare peptidoglicano inserimento modelli1,2, 3,4. Mentre etichettatura fluorescente vancomicina è stato utilizzato per acquisire conoscenze nel peptidoglicano modelli di inserimento nei batteri gram-negativi fisso5, la membrana esterna generalmente fornisce una barriera di permeabilità che impedisce l'utilizzo di fluorescente antibiotici come una sonda per la biosintesi del peptidoglicano in cellule vive. Al contrario, brevi impulsi di fluorescente-d-amminoacidi o d-amminoacidi con gruppi funzionali biortogonali etichetta covalentemente regioni di recente inserimento di peptidoglicano in una vasta gamma di vita cellule batteriche6,7. Modelli di inserimento di peptidoglicano che sono stati osservati con d-amminoacidi sintetici includono punctate e settale (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e settale (Agrobacterium tumefaciens e Monocytogenes di Listeria), unico settale (Staphylococcus aureus) e apicale (Streptomyces venezuelae)6,7. Queste osservazioni indicano che i batteri presentano diversi modelli di biogenesi della parete cellulare e che l'uso degli acidi d-amminoacido sintetici come sonde per l'esame di patterning di crescita è una strategia importante in molti batteri.

Coloranti che etichettano cromosomi batterici comprendono il legante specifico solco minore di acido desossiribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e ad alta affinità cianina coloranti (verde e arancione; vedere elenco dei materiali). DAPI macchiatura delle celle fisse assiste nell'enumerazione dei batteri da campioni ambientali8, mentre DAPI macchiatura delle celle in tensione viene utilizzata per indicare la vitalità batterica9. Al contrario, la cianina coloranti come arancione e verde sono spesso descritti come cellule "morte" impermeant membrana le macchie per enumerare le cellule non vitali9. Notevolmente, quando questi reattivi sono utilizzati per sondare la morfologia del nucleoide batterico durante la crescita delle cellule, DAPI, arancione e verde erano tutti indicati per essere membrana permeante e capace di etichettatura cellule vive10. In e. coli cellule vive, DAPI macchiatura del DNA appare diffusa a causa di auto-fluorescenza dal citoplasma ed esposizioni ripetute delle cellule DAPI-macchiato ai raggi ultravioletti (UV) perturba il nucleoide struttura10. Colorazione e. coli o Bacillus subtilis con Orange rivela che questa tintura è membrana permeante e fornisce lunga durata fluorescenza legandosi al DNA in cellule vive senza influire sulla crescita cellulare, replicazione del DNA o segregazione del cromosoma10 . Queste osservazioni suggeriscono che cianina DNA coloranti possono essere utilizzati per monitorare la morfologia del nucleoids durante la crescita delle cellule in molti batteri.

Phospholipid-specific stryl coloranti quali N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro di pyridinium (4-64; veda lista materiali) sono composti cationici e associare preferenzialmente con carica negativa fosfolipidi come la cardiolipina e fosfatidilglicerolo11. Modelli distinti sono osservate quando 4-64 è usato per etichettare la membrana di batteri diversi. In Escherichia coli, 4-64 si arricchisce nei poli, nelle bande lungo la parete laterale e nei siti di divisione di ritardo pre-divisional cellule12. In Bacillus subtilis, 4-64 etichettatura consente la visualizzazione di lipido spirali13. In Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etichette la membrana esterna e si osserva in un modello caratteristico "ferro di cavallo" in cui il Polo di crescita è privo di etichettatura14,15. Queste osservazioni indicano che questi batteri presentano distribuzioni eterogenee dei lipidi a causa della presenza di domini lipidici che contribuiscono alla asimmetria cellulare. Cambiamenti nei modelli di etichettatura 4-64 come la presenza di etichettatura diffusa, vescichette o vescicole, i invaginations o restringimento della membrana può essere informativo nella caratterizzazione dei mutanti che influenzano la distribuzione o la biosintesi dei lipidi.

Limita macchiatura delle celle, determinare la funzione delle proteine che partecipano a processi essenziali è necessario. La caratterizzazione delle proteine essenziali è tecnicamente impegnativa perché non è possibile eliminare geni essenziali e studiare le conseguenze fenotipiche. Così, sono emersi approcci alternativi che riducono la proteina. Ad esempio, un gene essenziale può essere messo sotto il controllo di un promotore inducibile anziché suo promotore nativo. Promotori inducibili sono sensibli a reagire a piccole molecole come; 16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosio22, Vanillato17,23, di zinco e xilosio23, così la trascrizione del gene target cessa e la proteina di interesse è esaurita quando l'induttore viene rimosso. Approcci alternativi per esaurire le proteine essenziali di interesse includono riboswitches sintetico24 che utilizzare interazioni di piccola molecola-RNA per ostacolare la trascrizione di geni bersaglio, CRISPR interferenza25,26 blocco la trascrizione di geni bersaglio e proteina viscoelastica degradazione27,28 , che utilizza i tag di peptide proteine bersaglio per degradazione dalla proteasi ClpXP. Ceppi di svuotamento forniscono solo un breve periodo per caratterizzazione prima le cellule perdono vitalità, di conseguenza, la formazione immagine microscopica delle cellule nel tempo durante lo svuotamento della proteina è un approccio potente per caratterizzazione. Infatti, microscopia di cellule batteriche viventi ha permesso ai ricercatori di acquisire conoscenze in processi biologici fondamentali, compresi i meccanismi di mantenimento di forma delle cellule, secrezione e compartimentalizzazione29.

A. tumefaciens è un impianto batterico patogeno30 e ingegnere genetico naturale31,32. Così, tra cui meccanismi correlati alla patogenicità, ospite-patogeno interazioni33,34,35, secrezione36e host trasformazione30,31, 37 sono stati studiati. Per progettare strategie che prevenire le malattie a. tumefaciens mediata o migliorare impianto trasformazione, è necessario comprendere meglio i processi essenziali per la sopravvivenza di a. tumefaciens . L'uso di coloranti specifici per la destinazione e il recente sviluppo di una strategia di svuotamento della proteina per a. tumefaciens18 fornisce un mezzo per indagare i processi essenziali.

Qui, protocolli dettagliati per l'analisi al microscopio dei ceppi di svuotamento wildtype, mutante e proteina di a. tumefaciens sono forniti. I primi due protocolli descrivono come preparare cellule ed etichettarli con coloranti specifici per la destinazione. Il terzo protocollo vengono fornite istruzioni dettagliate per la preparazione dell'agarosi pastiglie (Figura 1) e imaging le cellule batteriche (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Questi protocolli possono anche essere adatti per altri batteri con ulteriori adattamenti per tenere conto per media differenti condizioni, tassi di crescita, fabbisogno di ossigeno e strutture cellulari.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. crescita di ceppi di a. tumefaciens

  1. Coltura a. tumefaciens ceppi
    1. Usare una punta in legno sterile di bastone o una pipetta per inoculare 1 mL di coltura ATGN (Vedi la lista dei materiali per la ricetta) con una singola Colonia del ceppo desiderato.
      Nota: Per i ceppi di svuotamento di a. tumefaciens , il ATGN deve contenere 1 mM IPTG come induttore per mantenere la biosintesi della proteina essenziale.
    2. Crescere i ceppi di a. tumefaciens pernottamento in ATGN a 28 ° C con agitazione a 225 giri/min.
    3. Misurare la densità ottica delle cellule a 600 nm (OD600) usando uno spettrofotometro. Diluire la coltura cellulare a un OD600 = ~0.2 e continuano a crescere fino al OD600 = ~0.6 è raggiunto. Per i ceppi di svuotamento, continuare a crescere con induttore fino OD600 = ~0.6 è raggiunto.
    4. Utilizzare ceppi wildtype e mutante di a. tumefaciens OD600 = ~0.6 per colorazione specifica della destinazione e/o microscopia time-lapse (vedere paragrafi 2 e 3.1). Per i ceppi di svuotamento, lavare l'induttore (Vedi punto 1.2.)
  2. Rimozione di induttore per la caratterizzazione dei ceppi di a. tumefaciens proteina svuotamento
    1. A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga a temperatura ambiente.
    2. Per lavare, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in media fresco senza induttore e appallottolare le celle come descritto sopra (1.2.1). Lavare le cellule un totale di 3 volte nei mezzi freschi.
    3. Risospendere il pellet finale nei mezzi freschi e concentrare le cellule a un OD600 = ~0.8 per immediata colorazione con coloranti specifici target (sezione 2 e Figura 4B-D) o microscopia time-lapse (sezione 3.2 e Figura 4A) . In alternativa, pre-vuotano le cellule per la quantità desiderata di tempo coltivando le cellule in media senza induttore prima della colorazione e imaging delle cellule.

2. specifica della destinazione macchiatura delle cellule di a. tumefaciens

  1. Parete delle cellule fluorescenti acido ammino etichettatura
    Nota: FDAAs sono atossici fluorescenti d-amminoacidi che sono prontamente incorporati il peptidoglicano di a. tumefaciens . Questa semplice procedura d'etichettatura sonde crescita patterning in cellule vive6. Protocolli per la sintesi di quattro FDAAs sono disponibili38.
    1. A pellet 500 µ l di cultura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga. Risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di mezzi freschi.
    2. Aggiungere 5 µ l di 5mm FDAA a lavato e concentrati di cellule e incubare per 2 min al buio.
      Nota: Limitare l'esposizione FDAA alla luce. Il tempo di incubazione varia a seconda del tasso di crescita del ceppo. In genere, i tempi di incubazione dovrebbero essere 5-10% del tempo raddoppiantesi6.
    3. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione e lavare le palline delle cellule con tamponato fosfato salino (PBS) tre volte.
    4. Risospendere il pellet in ~ 50 µ l PBS.
      Nota: Il volume di PBS utilizzato per risospensione può variare basato sul formato della pallina.
    5. Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente (vedere paragrafi 3.1 e 3.2).
      1. In alternativa, arrestare ulteriore incorporazione di etichetta riparando le cellule con etanolo al 70% ghiacciata. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di etanolo al 70% ghiacciata e incubare in ghiaccio per 15 minuti.
      2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere in un piccolo volume di PBS per l'imaging in un secondo momento. Conservare le sospensioni delle cellule a 4 ° C e immagine entro 48 ore.
  2. DNA di colorazione con DAPI o macchia arancia
    Nota: Per osservare il DNA struttura, le cellule sono etichettate con DAPI o Orange (macchia di cellule morte). Anche se classicamente descritto come una "macchia di morti-cell", Orange è permeante, fotostabile e non influenza la crescita delle cellule batteriche, attivazione del DNA di cellule vive10di imaging. In a. tumefaciens, arancia etichettatura funziona bene nelle cellule viventi ed è adatto per la microscopia time-lapse (Figura 3). Al contrario, ultravioletta (UV) esposizione alla luce necessaria per imaging DAPI-macchiato le cellule è fototossico (Figura 3) e quindi colorazione DAPI è più adatto per la colorazione di cellule vive per immediato di imaging o colorazione celle fisse.
    1. DAPI macchiatura delle cellule
      1. A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga.
      2. Facoltativamente, per correggere le cellule prima della colorazione, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di etanolo al 70% ghiacciata. Incubare in ghiaccio per 10-15 min. raccogliere le cellule per centrifugazione come descritto in 2.2.1.1.
      3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contenente 1 µ l di soluzione madre di DAPI (1 mg/mL; Vedi Materiali tavolo). Mescolare delicatamente pipettando e incubare per 5 minuti al buio.
      4. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min e risospendere in 1 mL di PBS per rimuovere l'eccesso DAPI. Lavare le cellule altre due volte e risospendere il pellet in 50 µ l PBS o supporti.
      5. Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente. Vedere paragrafi 3.1 e 3.2.
        Nota: Questo protocollo non è ottimo per microscopia time-lapse per osservare cromosoma dinamiche (Figura 3). Considerare l'utilizzo di colorazione arancione come alternativa (vedere paragrafo 2.2.2).
    2. Colorazione arancione di cellule vive
    3. A pellet 1 mL di coltura esponenziale (OD600 = ~0.4-0.6) mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 min in una desktop centrifuga. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS contenente 1 µ l di soluzione madre arancione (vedere elenco dei materiali). Mescolare delicatamente pipettando e incubare per 5 minuti al buio.
    4. Pellet di cellule mediante centrifugazione e risospendere in 1 mL di PBS per rimuovere l'eccesso arancione. Lavare le cellule altre due volte e risospendere il pellet in 50 µ l PBS.
    5. Applicare 0.8-1 µ l di cellule di un pad di agarosio e immagine utilizzando epifluorescenza immediatamente. Vedere paragrafi 3.1 e 3.2.
      Nota: Questo protocollo funziona bene con cellule vive ed è adatto per la microscopia time-lapse di osservare le dinamiche del cromosoma (Figura 3). Se non è conveniente per l'immagine immediatamente, le cellule possono essere fissate in etanolo al 70% ghiacciata (Vedi sezione 2.2.1.2).
  3. Etichettatura di membrana
    Nota: Il colorante fluorescente lipofilico styryl 4-64 è stato usato estesamente per osservare la membrana delle cellule batteriche. A differenza di molti batteri, 4-64 etichettati a. tumefaciens cellule non etichettare in modo uniforme, ma piuttosto frequentemente esibiscono un "ferro di cavallo" modello14,15. Notevolmente, il Polo di crescita è quasi priva di macchia mentre il vecchio palo intensamente con l'etichetta. Così, 4-64 permette la visualizzazione della struttura di membrana in a. tumefaciense modelli di crescita delle cellule.
    1. Aggiungere FM 4-64 a una concentrazione finale di 8 µ g/mL in 1 mL di coltura cellulare fase esponenziale e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio.
    2. Pellet con etichettate cellule mediante centrifugazione a 7.000 x g per 5 minuti in una centrifuga di desktop e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Lavare le cellule un totale di tre volte per rimuovere il colorante in eccesso.
    3. Risospendere le cellule in un piccolo volume di PBS e spot su un pad di agarosio all'immagine immediatamente. (Vedere paragrafi 3.1 e 3.2)
      Attenzione: Le cellule devono essere imaged immediatamente per osservare i modelli caratteristici di etichettatura.

3. imaging delle cellule di a. tumefaciens

  1. Preparazione del tampone di agarosio
    Nota: Nella figura 1 contiene una sequenza di immagini (pannello A) e schema (pannello B) di un pad di agarosio tipici preparato per microscopia time-lapse. Pastiglie di agarosio sono tipicamente preparate secondo le necessità.
    1. 3.1.1. usare un vetrino coprioggetti come una guida e tagliare un 22 x 22 mm quadrati di laboratorio film (Vedi elenco materiali) eseguendo un bisturi intorno ai bordi.
    2. Ritagliare un quadrato fuori dal centro del film laboratorio lasciando un ~ 2-5 bordo mm per servire come una guarnizione per il pad di agarosio. Scartare il ritaglio di centro.
    3. Posizionare la guarnizione di film su una lastra di vetro (75 x 25 mm) pulita con un detergente privo di alcool e ammoniaca (vedere elenco dei materiali) e scaldare fino a quando il film è leggermente sciolto sul vetro (immagine in alto in Figura 1A). Per sciogliere il parafilm, utilizzare il bordo di un set di blocco del calore a 70 ° C o fondere leggermente sopra una fiamma.
    4. Preparare la soluzione di agarosio mescolando ~0.075 g agarosio (Vedi elenco materiali) in 5 mL di media in una piccola boccetta. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde con periodiche vorticoso per mescolare fino a quando si scioglie l'agarosio e la soluzione è limpida. Tenere la soluzione di agarosio a 55-70 ° C ed utilizzare per la costruzione di più dell'agarosi pastiglie entro 48 ore.
    5. Pipetta supporti contenenti 1.2-1.5% di agarosio nel centro della guarnizione.
      Nota: Il volume dei media è in genere 50-60 µ l ma varia in base alla dimensione della guarnizione. Aggiunta di media a una diapositiva fredda può causare l'agarosio a solidificare troppo in fretta, così la diapositiva dovrebbe essere tenuta su una superficie calda. Il bordo di un blocco di calore imposta a 70 ° C funziona bene. Acqua dell'agarosi o soluzioni di agarosio tamponato come tamponato fosfato salino (PBS) possono essere utilizzati invece di supporto contenente agarosio per applicazioni in cui la crescita continua delle cellule non è necessaria. Per l'imaging di ceppi di svuotamento, induttore possa essere presenti o assenti nei media. Presenza di induttore può essere utilizzato come controllo, considerando che l'assenza di induttore rivelerà il fenotipo di svuotamento.
    6. Posizionare un vetrino coprioggetto sopra la guarnizione per distribuire uniformemente l'agarosio.
    7. Porre il vetrino su una superficie piana, cool per solidificare per ~ 2 min evitare sgualciscano del pad agarosio come questo si tradurrà in una superficie rugosa sul pad di agarosio e pool della sospensione delle cellule quando applicato sulla superficie.
    8. Far scorrere delicatamente il vetrino coprioggetto dal cuscinetto di agarosio.
      Attenzione: Non correre questo passaggio. Il pad di agarosio può facilmente strappare e un pad di agarosio irregolare può rendere difficile la formazione immagine.
    9. Consentire il pad di agarosio per aria secca per 1-2 min a temperatura ambiente fino a quando la superficie del pad sembra asciutta. Usando un bisturi, rimuovere una piccola striscia di agarosio per creare sacche d'aria (immagine centrale, Figura 1A); la sacca d'aria è in genere ~ 2 x 7-10 mm e a. tumefaciens cellule tendono a crescere meglio vicino la sacca d'aria (Figura 1).
      Nota: Per l'imaging delle cellule fisse o nelle circostanze dove la crescita non è monitorata, sacca d'aria non è necessaria.
    10. Luogo: 0.8-1 µ l di cellule su agarosio pad e coprire con un vetrino coprioggetto di nuovo. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto sopra la parte superiore del riquadro dell'agarosi per distribuire le cellule su tutta la superficie del pad dell'agarosi.
    11. Sigillare i bordi del coprivetrino utilizzando VALAP fuso (Vedi Materiali tavolo per ricetta; Figura 1A, parte inferiore dell'immagine). Per sigillare lungo tutti i bordi e gli angoli del coprivetrino potrebbe causarti essiccazione del pad agarosio, che porterà alla deriva delle cellule durante la formazione immagine. Nota: Tenuta del coprivetrino è necessaria solo per l'imaging di time-lapse a lungo termine.

figure-protocol-1
Figura 1: preparazione di agarosio pad. (A) sequenza del protocollo dell'agarosi pad preparazione della battuta. Immagine 1 è una diapositiva con la guarnizione di film di laboratorio. Nell'immagine 2, vengono visualizzati il pad di agarosio e la sacca d'aria. Infine, immagine 3 Mostra il pad di agarosio completa con le cellule sotto un coprioggetto e sigillato con VALAP. (B) un disegno schematico di un pad di agarosio per microscopia time-lapse è fornito. Caratteristiche principali del pad agarosio sono etichettate sullo schema. (C), la sacca d'aria promosso la crescita di a. tumefaciens su agarosio pastiglie. Immagini di wildtype a. tumefaciens cellule coltivate su un pad di agarosio per 20 ore sono indicate. Immagini sono state scattate alle posizioni sempre più distanti dalla sacca d'aria. La distanza tra il bordo più vicino dell'immagine la sacca d'aria è indicata sopra ogni immagine. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Di imaging
    Nota: Contrasto differenziale di interferenza, contrasto di fase ed epifluorescenza imaging viene eseguita con un microscopio invertito dotato di messa a fuoco automatica basata su hardware, una fase automatizzata, filtri standard, una sorgente di luce LED, immersione in olio 60 X obiettivi (1,4 NA) per contrasto di fase o contrasto differenziale di interferenza (DIC) e una fotocamera di charge-coupled-device (EMCCD) elettrone-moltiplicando 1K. Il microscopio deve essere messo in una camera a temperatura controllata. In alternativa, una fase più calda o una camera può essere utilizzato per mantenere la temperatura costante durante la formazione immagine.
    1. Epifluorescenza
      Nota: Per l'imaging di fluorescenza di cellule vive, è necessario limitare il numero di acquisizioni di immagine e ottimizzare il tempo di esposizione per ridurre al minimo photobleaching e fototossicità. Per l'imaging di ogni colorante, si consiglia di trovare un tempo di esposizione ottimale che fornisce sufficiente rilevazione della fluorescenza, ma non porta a photobleaching o fototossicità. Figure 2-4, tempi di esposizione di 200 ms sono stati utilizzati per tutte le immagini di fluorescenza. Per le sequenze di time-lapse illustrate nella Figura 3, immagini sono state acquisite ogni 10 min per 3 h.
      1. Mettere olio da immersione sull'obiettivo desiderato e porre il vetrino invertito nel porta-diapositive sul palco. Utilizzare le manopole di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule.
      2. Acquisire immagini in fase (o DIC) e il filtro di fluorescenza desiderato.
        Nota: La massima eccitazione e emissione lunghezze d'onda per le macchie utilizzate in Figura 2, Figura 3e Figura 4 sono come segue: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), arancione (547/570).
    2. Time-lapse microscopia
      Nota: Durante la microscopia time-lapse le funzionalità seguenti sono controllati dal computer: x, y e z posizione, persiane e fluorescenza filtri. Un sistema basato su hardware auto-focus è ottimo per mantenere lo stato attivo durante la formazione immagine di time-lapse. In alternativa, può essere utilizzato un ciclo di messa a fuoco automatica basata su software.
      1. Mettere olio da immersione sull'obiettivo desiderato e porre il vetrino invertito nel porta-diapositive sul palco. Utilizzare le manopole di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule.
      2. Facoltativamente: Acquisire più (x, y) posizioni. Selezionare casualmente 10 campi delle cellule nella prossimità vicina alla sacca d'aria dei pattini dell'agarosi.
      3. Set-up l'acquisizione di sequenza tempo all'immagine in fase o DIC a intervallo di tempo desiderato.
        Nota: Per la sequenza di time-lapse illustrata nella Figura 4, DIC immagini sono state acquisite con l'esposizione di 30 ms ogni 10 min per 14 h. Quando si utilizza l'imaging di fluorescenza durante la microscopia time-lapse, regolare il tempo di esposizione e intervallo di acquisizione per minimizzare photobleaching e fototossicità.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Target-specifici di etichettatura di wildtype A. tumefaciens cellule
Per illustrare che la morfologia delle cellule non è influenzato dal trattamento con 1% DMSO (che viene utilizzato per diluire i coloranti fluorescenti) o fasi di lavaggio, le cellule erano imaged direttamente dalla cultura (Figura 2A, pannello di estrema sinistra), dopo aver lavato le cellule di centrifugazione, come descritto ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo contiene una serie di procedure per l'indagine dei ceppi di a. tumefaciens wildtype, mutante e svuotamento. Vale la pena notare che tutte le procedure elencate nella sezione protocollo può essere facilmente adattate per altri ceppi batterici con ulteriori modifiche per tenere conto per crescita media, temperature e tassi di crescita.

L'uso di coloranti specifici per la destinazione è uno strumento prezioso per fornire una caratterizzazione dettagliata degli eventi de...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Michael VanNieuwenhze (Indiana University) per il dono della FDAAs utilizzato nella Figura 2 e Figura 4. Ringraziamo i membri del lab marrone per feedback durante la preparazione di questo manoscritto. Ricerca in laboratorio marrone sulla divisione e crescita delle cellule di a. tumefaciens è supportato dalla National Science Foundation (IOS1557806).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ceppi batterici
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmide necessario per la virulenza di Agrobacterium tumefaciens. J Batteriolo 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA & Delta; ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. L'inserimento di Mini-Tn7 in un sito artificiale attTn7 consente la depelzione del regolatore principale essenziale CtrA nel fitopatogeno Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NomeAziendaCatalog Number>Comments
Media Components
ATGN Minimum MediumA 1 L di acqua sterilizzata aggiungere 50 ml di tampone 20X, 50 ml di sali 20X, 12,5 ml di glucosio al 40%. Per i piatti, aggiungere 15 g di Bacto Agar a 1 L di acqua e in autoclave. Raffreddare a 55 gradi C e aggiungere 50 ml di tampone 20X, 50 ml di sali 20X, 12,5 ml di glucosio al 40%.
AT 20XAggiungere 214 g/L di KH2PO4 all'acqua e regolare il pH a 7,0 con idrossido di sodio. Autoclave.
NaOH Fisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT Sali Aggiungere40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4&toro; 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O e 0,024 g/L di MnSO4• H2O all'acqua. Autoclave.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlucosioFisher ChemicalD16Preparare il 40% del brodo in acqua. Filtro sterilizzare.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Aggiungere 15 g a 1 L di acqua durante la preparazione dei piatti.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Additivi opzionali per supporti
KanamycinGoldBioK-120Preparare come soluzione madre da 100 mg/ml in acqua e filtrare sterilizzare. Utilizzare alla concentrazione finale di 200 µ g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Preparare come soluzione madre da 1 M in acqua e sterilizzare con filtro. Utilizzare alla concentrazione finale di 1 mM secondo necessità per l'induzione.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Materiali per microscopia
Vetrini per microscopioFisherbrand12-550D25 X 75 X 1,0 mm. Pulire con il detergente per vetri Sparkle.
Vetro di copertura per microscopioFisherbrand12-541-B22 x 22 mm. N. 1.5. Pulisci con il detergente per vetri Sparkle.
Sparkle Glass CleanerHome Depot203261385senza ammoniaca e alcool.
Agarosio Ultra PuroInvitrogen16500-100Aggiungere all'acqua, al PBS o al terreno di coltura fino a una concentrazione finale dell'1 - 1,5%. Sciogliere nel microonde e porre su 70 C
PBSFisher BioReagentsBP399500soluzione 10X da diluire a 1X con acqua sterile.
ParafilmBemisPM-999Film da laboratorio utilizzato come guarnizione nella preparazione di tamponi di agarosio.
VALAPAggiungere pesi uguali di lanolina, cera di parafina e vaselina in un tubo conico. Tubo di calore in 70 gradi C secco, perlina o bagnomaria per sciogliere e mescolare. Applicare VALAP ancora fuso.
Burro di lanolinaSAAQINSQ-LAB-R1
VaselinaTarget Corp.06-17644
cera di paraffina263012
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Coloranti specifici per bersaglio
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Utilizzare per diluire le soluzioni stock di coloranti secondo necessità.
FDAA (NADA, HADA, TADA)LeFDAA possono essere sintetizzate o acquisite attraverso un accordo con Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Preparare 100 mM di soluzione stock in DMSO. Utilizzare a una concentrazione finale di 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Preparare una soluzione madre da 1 mg/ml in DMSO. Utilizzare alla concentrazione finale di 1 & micro; g/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid StainInvitrogenS11368La concentrazione di stock è di 5 mM in DMSO. Utilizzare alla concentrazione finale di 5 µM.
FM4-64InvitrogenT3166Preparare una soluzione madre da 8 mg/ml in DMSO. Utilizzare alla concentrazione finale di 8 & micro; g/ml.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Equipment
Bagno a seccoSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Perle termiche metallicheArmatura da laboratorio42370-002
Microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocameraIn questo lavoro viene utilizzato Nikon Eclipse TiE dotato di una fotocamera QImaging Rolera em-c2 1K per dispositivo accoppiato a moltiplicazione di elettroni (EMCCD).
Tampone Candele artigianali in EMCDD

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Time lapse MicroscopyBacterial Cell GrowthDNA ReplicationProtein SynthesisCell Wall BiosynthesisCell DivisionFluorescent DyesNucleic Acid StainsAgrobacterium Tumefaciens

Articoli correlati