Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.
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Articolo metodologico
Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l'anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L'attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L'originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell'acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.
Introduzione
Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto1. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti
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Protocollo
Tutti i campioni di sangue periferico umano sono stati ottenuti da donatori anonimi adulti dopo consenso informato, secondo il comitato etico locale (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedura accoppiatore NTS-2016-08).
1. isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano
Nota: Il materiale di partenza può essere totale del sangue periferico umano o Citaferesi campioni. Campioni non devono essere più vecchi di 8 h e completati con anticoagulanti (ad es., eparina).
- Diluire il sangue con 2 volumi (sangue periferico umano) o 5 volumi (esempio Citaferesi) di medium RPMI ....
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Risultati
A partire da PBMC da donatori sani, questo project presenta la generazione di anticorpi monoclonali umani, che riconoscono il peptide Pp65495 (Pp65, da citomegalovirus umano) presentata dalla classe complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) molecola HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Questi anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra questo complesso e complessi che rappresentano altri peptidi caricati su stesso MHC-ho molecola.
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Discussione
Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l'uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a flus.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la struttura Cytometry "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutto il personale di produzione di proteine ricombinanti (P2R) e di piattaforme di impatto (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Emmanuel Scotet e Richard Breathnach per commenti costruttivi sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto IHU-Cesti finanziato dal programma di governo francese «Investissements d'Avenir», gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HEK 293A linea cellulare | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco di life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucosio 0,11g/L Piruvato di sodio (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Fosfato Soluzione Salina Tamponata (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Acido etilendiamminotetraacetico) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - separazione dei linfociti medio | EuroBio | CMSMSL01-01 | densità 1,0777+/-0,001 |
| streptavidina R-ficoeritrina coniugato | Invitrogen di Life Technologies | S21388 | grado premiun 1mg/ml contiene 5mM di sodio azide |
| streptavidina, alloficocianina coniugato | Invitrogen di thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide di prima qualità |
| Brilliant violet 421 streptavidina | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Microsfere magnetiche coniugate anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Microsfere magnetiche coniugate anti-APC | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs o separatore QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| Colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Diluizione usata 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Diluizione usata 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Diluizione usata 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Diluizione usata 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Diluizione usata 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Citometro | BD Biosciences | ||
| Provette PCR a 8 strisce | Axygen | 321-10-061 | |
| Rack per 96 microprovette | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Inibitore della ribonucleasi (ricombinante) | Invitrogen di thermoFisher scientific | 10777-019 | qtà:5000U (40U/ul) |
| Acqua distillata Senza Dnase/Rnasi | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Esameri casuali | Invitrogen di thermoFisher scientific | N8080127 | qtà: 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Trascrittasi inversa | Invitrogen di thermoFisher scientific | 18080-044 | qtà : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, grado di biologia molecolare | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane - Screening PCR di batteri |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTCAGCTGGTGCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer 5AgeIVH6_1 |
| Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti | |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGTGACCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGTGGTGTG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi |
| 5' LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCCTCTGC TACTCTGGCTCCCAG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer diretti |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer inversi - Screening PCR batterico |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVk1_9_1– 13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer in avanti |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC Secondo | ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Forward primer |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG | Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Forward primer |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG | Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni -Primer inversi - Screening PCR |
| batterico Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC | Screening PCR batterico |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzima SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzima Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzima BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (numero di accesso Genbank FJ475055) | |||
| LCk (numero di accesso Genbank FJ475056 | |||
| LCl (adesione Genbank numero FJ517647) | |||
| T4 DNA ligasi | Invitrogen di thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medio | Sigma | Aldrich Y1003-500ML | |
| Ampicillina | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Brodo (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmide DNA, RNA e per purificazione di proteine | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI Reagente per trasfezione DNA | PolyPlus | 101-40 | |
| Fondo piattoPiastra a 96 pozzetti | Falcon | 353072 | |
| Piastra a 96 pozzetti con fondo a V | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 Flaconi | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT tampone di rivestimento | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp fondo piatto 96 pozzetti Piastre ELISA | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | alto legame proteico |
| Anti-IgG umano Ab coniugato alla perossidasi di rafano (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| Substrato TMB | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidina | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap proteina A colonna HP | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| Ä Colonna KTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus | BioRad | 7880003 |
Riferimenti
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 ....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
