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Articolo metodologico

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

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DOI:

10.3791/56508

⸱

6 febbraio 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

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Sommario

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l'anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L'attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L'originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell'acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.

Introduzione

Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto1. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti2.

Il primo mAbs sono state prodotte da immunoglobulina (Ig)-secernendo ibridomi ottenuti dalle cellule spleniche di topi immunizzati o ratti. Tuttavia, la forte risposta immunitaria contro anticorpi monoclonali murini o ratto ostacola il loro uso terapeutico negli esseri umani, a causa della loro rapida clearance e il probabile induzione di reazioni di ipersensibilità3. Per affrontare questo problema, sequenze di proteine animali di mAbs sono stati parzialmente sostituiti da quelli umani per generare i cosiddetti anticorpi chimerici topo-umani o umanizzati. Tuttavia, questa strategia diminuisce solo parzialmente immunogenicità, aumentando sostanzialmente sia il costo e il tempo-scala di produzione. Una soluzione migliore è quello di generare anticorpi monoclonali umani direttamente da linfociti B umani e sono disponibili diverse strategie per questo. Uno di loro è l'uso del display dei fagi o lievito. Questo comporta la visualizzazione di domini variabili da una libreria combinatoria di Ig umana casuale pesanti e catene leggere su fagi o lieviti e realizzazione di un punto di selezione usando l'antigene specifico di interesse. Un grande svantaggio di questa strategia è che le catene pesanti e chiare sono casualmente associate, portando ad un aumento molto grande nella diversità degli anticorpi generati. Gli anticorpi ottenuti difficilmente corrispondono a quelli che deriverebbero da una risposta immunitaria naturale contro un particolare Ag. Inoltre, modificazioni post-traduzionali e ripiegamento di proteine umane non sono sistematicamente riproducibili nei procarioti o anche nei lieviti. Un secondo metodo di produzione di mAb umana è l'immortalizzazione dei linfociti B umani naturali, dall'infezione del virus Epstein - Barr o espressione dei fattori anti-apoptotico BCL-6 e BCL-XL4. Tuttavia, questo metodo è applicabile solo alle cellule di B di memoria ed è inefficiente, che richiede la selezione delle cellule di B immortalizzate mAb-producendo numerose per identificare i cloni di mAb pochi (se presente) con la specificità antigenica desiderata. Il metodo è così costoso e che richiede tempo.

Recentemente è stato descritto un nuovo protocollo per la produzione di mAbs umana da isolato singolo B cellule5. Essa si basa su un ottimizzato unicellulare Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per l'amplificazione di entrambi i pesanti - e della luce-catena codifica segmenti da una singola cellula B ordinata. Questo è seguito dalla clonazione e l'espressione di questi segmenti in un sistema di espressione eucariotico, permettendo così la ricostruzione di un mAb pienamente umana. Questo protocollo è stato usato con successo a partire da cellule B da donatori vaccinati. Le cellule sono state raccolte diverse settimane dopo la vaccinazione per ottenere frequenze più alte delle cellule di B dirette contro l'Ag desiderato e quindi limitare il tempo necessario per lo screening di6. Altri mAbs pienamente umana sono state prodotte anche da pazienti infetti da HIV+ (Virus dell'immunodeficienza umana)7 e melanoma pazienti8. Nonostante questi progressi, non c'è ancora nessuna procedura disponibile che permette l'isolamento di cellule B Ag-specifici indipendenti del loro fenotipo memoria o la frequenza.

La procedura descritta qui conduce all'isolamento efficiente ex vivo di cellule B circolanti umane basato sulla loro specificità BCR, seguita dalla produzione di pienamente umano mAbs antigene-specifiche nell'alto rendimento e con un tempo di proiezione bassa. Il metodo non è limitato a cellule B memoria o cellule B disecrezione indotte dopo una risposta immunitaria, ma può essere applicato anche al repertorio delle cellule di B ingenui umano. Che funziona anche a partire da cellule B Ag-specifici presenti a frequenze molto basse è una buona indicazione della relativa efficienza. Il principio del metodo è come segue: le cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC) sono macchiati con due tetrameri che presentano l'antigene di interesse, ognuno etichettato con un fluorocromo diverso (ad es., ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e un terzo tetramero presentando un antigene strettamente correlato coniugato con un fluorocromo terzo (ad es., Brillant Violet 421 (BV421)). Per arricchire per le cellule antigene-legante, le cellule sono poi incubate con perline rivestite con anti-PE e Abs anti-APC e ordinati in colonne di separazione delle cellule. La frazione di cellule APC PE+ + è selezionata, macchiato con una varietà di anticorpi specifici per diversi tipi di cellule PBMC permettere l'identificazione delle cellule di B e sottoposto al flusso cytometry ordinamento delle cellule. Cellule di B che sono PE+ e APC+, ma brillante viola-, sono isolate. Questo passaggio Counter-seleziona le celle che non sono le cellule B o non legarsi all'antigene tetramerized, ma associa al PE o APC (queste cellule saranno PE+ APC– o PE– APC+) o la parte non-antigene dei tetrameri utilizzato (questi le cellule saranno BV421+). Le cellule B non altamente specifiche per l'epitopo di interesse Counter-vengono selezionate anche in questa fase (queste cellule saranno anche BV421+). Pertanto, questo metodo può purificare altamente specifici linfociti B che esprimono recettori di cellule B (BCR) in grado di discriminare tra due antigeni molto strettamente correlati. Cellule B specifiche singole sono raccolti in provette e loro PCR-amplificato Ig cDNA (acidi desossiribonucleico complementari) clonato ed espresso da una linea cellulare umana come secrete IgG anticorpi monoclonali.

Come un proof of concept, questo studio descrive la generazione efficiente di mAbs umano, che riconosce un peptide ha presentato da una classe di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I) molecola e in grado di discriminare tra questo peptide e altri peptidi caricati sullo stesso MHC-I allele. Anche se il livello di complessità di questa Ag è importante, questo metodo (i) permette il recupero di ad alto rendimento di Marazzi Ag-specifici; (ii) la produzione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra due strutturalmente chiudere Ags. Questo approccio può essere esteso ai pazienti vaccinati o infetti senza alcuna modifica del protocollo e ha anche già stato implementato con successo in un ratto umanizzata sistema9. Quindi, questo studio descrive un approccio versatile ed efficiente per generare mAbs pienamente umano che può essere utilizzato nella ricerca di base e l'immunoterapia.

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Protocollo

Tutti i campioni di sangue periferico umano sono stati ottenuti da donatori anonimi adulti dopo consenso informato, secondo il comitato etico locale (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedura accoppiatore NTS-2016-08).

1. isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano

Nota: Il materiale di partenza può essere totale del sangue periferico umano o Citaferesi campioni. Campioni non devono essere più vecchi di 8 h e completati con anticoagulanti (ad es., eparina).

  1. Diluire il sangue con 2 volumi (sangue periferico umano) o 5 volumi (esempio Citaferesi) di medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Con attenzione strato 35 mL di sospensione cellulare diluito in 15 mL di medio gradiente di densità in una provetta conica da 50 mL. Faccia come molti tubi come necessarie per distribuire tutto il sangue diluito. Centrifugare a 1.290 x g per 25 min a temperatura ambiente in un rotore basculante con freno fuori.
  3. Attentamente aspirare lo strato delle cellule mononucleari all'interfaccia fra il mezzo di gradienti di densità e il livello del plasma e trasferire le cellule ad un nuovo tubo conico di 50 mL.
  4. Riempire il tubo con medium RPMI, mescolare e centrifugare a 1.290 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il supernatante.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di medium RPMI e centrifugare a 200 x g per 10 min rimuovere le piastrine. Rimuovere con cautela il supernatante. Ripetere questo passaggio una volta.
  6. Risospendere il pellet cellulare in medium RPMI con 10% siero bovino fetale (FBS).
    Nota: Passare direttamente alle tetramero etichettatura o mantenere le cellule a 4 ° C durante la notte ad una concentrazione di 107 cellule/mL.

2. tetramero-collegata di arricchimento magnetico delle cellule B Ag-specifici

  1. Preparare Ag-tetrameri aggiungendo entrambi PE o APC-etichetta premium grade streptavidina o BV421-labeled streptavidin con un rapporto molare di 1:4 ai monomeri di antigene biotinilato. Aggiungere la quantità appropriata di streptavidina-coniugato in tre porzioni separate, aggiungendo un'aliquota ogni 10 min a temperatura ambiente.
  2. Distribuire le cellule (fino a 3 x 108 a tubo) in provette coniche da 15 mL e centrifugare a 460 x g per 5 min.
    Nota: Il seguente protocollo è per un tubo.
  3. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS (Phosphate Buffered Saline) con 2% FBS. Aggiungere PE - APC- e BV421-coniugato tetrameri, ciascuno a una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Mescolare bene e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
  4. Preparare il tampone di separazione di cella ghiacciata (SB) con PBS con 0,5% BSA (albumina di siero bovino) ed EDTA (acido etilendiamminotetracetico) 2 mM.
  5. Aggiungere 10 mL di Pellet SB. cellule mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
  6. Risospendere le cellule in 500 µ l di gelida SB. aggiungere 50 µ l di anti-PE e 50 µ l di anti-APC microperle magnetiche.
  7. Mescolare bene e incubare per 20 min a 4 ° C.
  8. Ripetere il passaggio 2.5 due volte.
  9. Eliminare il surnatante attentamente andresuspend il pellet cellulare ad una concentrazione di 2 x 108 cellule/mL in ghiaccio freddo SB.
  10. Equilibrare una grande colonna magnetica posizionata su un magnete con 3 mL di SB.
  11. Trasferire la sospensione cellulare da 2,9 sulla parte superiore della colonna equilibrata e lasciarlo scolare completamente. PASSAGGIO critico: Per evitare di agglutinamento della colonna, passare le cellule attraverso una rete di nylon 70 µm.
  12. Sciacquare il tubo che conteneva le cellule con 3 mL di ghiaccio freddo SB e trasferire il tampone direttamente sulla colonna (in caso di filtrazione, maglia di nylon di sciacquare il 70 µm).
  13. Quando il buffer è completamente a vuoto nella colonna, è possibile aggiungere un altro 3 mL di ghiaccio freddo SB alla colonna.
  14. Ripetere il passaggio 2.13 per un altro lavaggio di 3 mL.
  15. Rimuovere la colonna dal magnete e posto sopra un tubo di raccolta conico 15 mL.
  16. Aggiungere 5 mL di ghiaccio freddo SB sulla parte superiore della colonna e sciacquare immediatamente le cellule fuori la colonna utilizzando lo stantuffo. Ripetere questo passaggio una volta.
  17. Centrifugare le cellule raccolte (frazione di cellule positivo arricchito tetramero pertinenti) a 460 x g per 5 min e procedere alla colorazione di anticorpo supplementare.
    Nota: Piscina raccolti le cellule da tutti i tubi, se appropriato.

3. colorazione delle cellule umane B Ag-specifici e ordinamento delle cellule

  1. Risospendere il pellet cellulare con un cocktail di anticorpi anti-umani CD3 (diluizione finale: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) e 7AAD (1: 1000) in un volume finale di 100 µ l di PBS con 2% FBS. Incubare per 30 min a 4 ° C.
  2. Aggiungere 10 mL di PBS alle celle, centrifuga a 460 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS, filtro sulla maglia di nylon 70 µm.
  3. Procedere per ordinare celle B specifiche a livello di singola cellula su un citometro di sorter delle cellule con un 100 µm-ugello e una pressione di 20 psi senza superare 1.000 eventi/s9.
    Nota: La strategia di gating utilizzata è illustrata nella Figura 1. Le cellule sono state prima gated il CD14–CD16 7AAD–– cellule per escludere i monociti, NK e cellule morte (non illustrate nella Figura 1). Quindi CD19+ B cellule sono state selezionate prima di gating su doppie cellule marcate da PE e APC pertinenti Ag-tetrameri. Cellule B non-specifici sono stati esclusi di gating su BV421 cellule negative (senza macchia da Ag-tetramero irrilevante).
  4. Raccolta di singole cellule di B in strip 8 provette per PCR precedentemente riempito con 10 µ l di 1X PBS e 10 unità di inibitore di RNAsi e collocati su una rastrelliera per microprovette 96 da. Bloccare immediatamente le provette PCR a-80 ° C.
    Nota: Le maschere di ordinamento scelte sullo strumento citometro sono resa maschera: 0, maschera di purezza: 32 e maschera di fase: 0. questo deposito di singola cellula poteva essere regolato per una piastra PCR a 96 o 384 pozzetti, se necessario. Cellule B singole devono essere congelate nel minor tempo possibile e possono essere lasciate a-80 ° C per diverse settimane, se necessario.

4. singola cella RT-PCR

  1. Lisare cellule riscaldando direttamente campioni congelati in strisce PCR a 70 ° C per 5 min in un bagno secco.
  2. Trasferimento strisce per ghiaccio e procedere ad invertire la trascrizione (RT) aggiungendo 10 µ l per provetta di un 2 x mix master tampone contenente 1mm dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) primer, 5 µM random esameri, 20 unità di inibitore di RNAsi e gli 400 unità della trascrittasi inversa.
    Nota: Dopo la cellula lo scongelamento, RT deve essere eseguita rapidamente per evitare la degradazione del RNA.
  3. Incubare a 25 ° C per 5 min consentire esameri casuali ibridare, quindi incubare per 1 h a 50 ° C e finire con un'incubazione a 95 ° C per 3 min arrestare la reazione.
  4. Procedere con due cicli di amplificazione di PCR annidata per ciascuna delle regioni codifica per variabile pesante (vH) e kappa (vLκ) o catene chiare di lambda (vLλ).
    Nota: In alternativa, i campioni di RT possono essere congelati a-20 ° C e tenuti per una settimana.
    1. Per il primo turno della PCR, aggiungere 3 µ l di cDNA per un volume finale di 40 µ l contenente 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 unità della DNA polimerasi e 200 nM di primer esterno (Vedi Figura 2 e Tabella materiali per sequenze dell'iniettore).
      Nota: Composizione del mix di primer esterno. Per l'amplificazione della catena pesante: 4 avanti primer (LVH mix di 5') e 2 reverse primer (3' CµCγ mix). Per l'amplificazione di catena leggera kappa, 3 avanti primer (5' LV | mescolare) e 1 reverse primer (3' Cκ543-566). Per l'amplificazione di catena leggera lambda, 7 forward primer (5' LVl mix) e 1 reverse primer (3' Cl).
      Nota: Gli iniettori sono stati progettati da Tiller et per l'amplificazione di tutti i geni della famiglia catena pesante e chiara5.
    2. Applicano le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 4 minuti, seguiti da 40 cicli di 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C per VH VLκ (60 ° C per VLλ) e 55 s a 72 ° C, con un allungamento finale passo a 72 ° C per 7 min.
    3. Per il secondo turno PCR, utilizzare 3 µ l del primo prodotto di amplificazione per un volume finale di 40 µ l contenente 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 unità della DNA polimerasi e 200 nM di primers interna contenente siti di restrizione enzimatica per la clonazione in espressione vettori (Vedi Figura 2 e Tabella materiali per sequenze dell'iniettore).
      Nota: Composizione del mix di primer interno. Per l'amplificazione della catena pesante: 9 primer (5' AgeIVH mix) in avanti e 3 indietro primer (3' SalIJH mix). Per l'amplificazione di catena leggera kappa, 9 forward primer (5' AgeIV | mescolare) e 3 reverse primer (3' BsiWIJκ mix). Per l'amplificazione di catena leggera lambda, 6 forward primer (5' AgeIVl mix) e 1 reverse primer (3' XhoICl).
      Nota: Gli iniettori sono stati progettati da Tiller et al., per l'amplificazione di tutti i geni della famiglia di catena pesante e chiara5.
    4. Applicano le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 4 minuti, seguiti da 40 cicli di 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C per VH LCκ (60 ° C per LCλ) e 45 s a 72 ° C con un allungamento finale passo a 72 ° C per 7 min.
  5. Identificare i pozzetti positivi di migrazione 5 μL di prodotti di PCR di vH, vLκ e vLλ su un gel di agarosio 1.5% (500 bp prodotti per segmenti codifica variabile della catena pesante) e un prodotto bp 350 per la variabile catena chiara codifica segmenti.
  6. Purificare i restanti 35 prodotti PCR µ l restanti da pozzetti positivi utilizzando membrane di ultrafiltrazione progettate per la purificazione dei prodotti di PCR.
  7. Eluire i prodotti di PCR con 60 µ l di H2O.

5. clonazione di espressione

  1. Preparare inserti
    Nota: Digerire 60 µ l di ogni PCR purificato prodotto in un volume finale di 100 µ l contenente il tampone di enzima di restrizione appropriato.
    1. Per i prodotti PCR di vH, aggiungere 50 unità di AgeI e 50 unità di SalI e incubare per 1h a 37 ° C.
    2. Per i prodotti PCR di vLλ, aggiungere 50 unità di AgeI e 50 unità di XhoI e incubare per 1h a 37 ° C.
    3. Per i prodotti PCR di vLκ, aggiungere 50 unità di AgeI e incubare per 1h a 37 ° C. Purificare il digest utilizzando 96 PCR membrane ed eluire con 60 µ l di H2O. Digest l'eluato 60 µ l in un volume finale di 100 µ l di tampone di enzima di restrizione BsiWI, aggiungere 50 unità di BsiWI e incubare per 1 h a 55 ° C.
    4. Inattivare gli enzimi da riscaldamento a 80 ° C per 15 min.
  2. Preparazione di vettori di espressione
    Nota: i prodotti di PCR vH vengono clonati in un vettore di espressione (HCγ1) contenente la catena pesante costante Cγ1 di IgG1. vLκ i prodotti di PCR sono clonati in un vettore di espressione (LCκ) contenente la catena leggera costante Cκ. vLλ i prodotti di PCR sono clonati in un vettore di espressione (LCλ) contenente la catena leggera costante Cλ.
    1. Eseguire le digestioni seguenti:
      1. Mix 1 µ g di espressione HCγ1 di vettore con 10 unità di AgeI e 10 unità di endonucleasi di SalI in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37 ° C.
      2. Mescolare 1 µ g di vettore di espressione LCκ con 10 unità di enzima di restrizione di AgeI in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37° C. Aggiungere 10 unità di enzima di restrizione BsiWI e incubare per 1 h a 55 ° C.
      3. Mescolare 1 µ g di vettore di espressione LCλ con 10 unità di AgeI e 10 unità di XhoI endonucleasi in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37 ° C
    2. Riscaldare ogni miscela di digestione a 65 ° C per 10 min inattivare gli enzimi di restrizione.
    3. Eseguire la legatura di 5 µ l di prodotto PCR digerito con 2 µ l (100 ng) del corrispondente vettore linearizzato espressione in un volume totale di 20 µ l di tampone di DNA ligasi 1x con 1 unità di T4 DNA-ligasi di incubazione overnight a 4 ° C.
      Nota: In alternativa, la legatura viene eseguita per 3 h a 4° C.
  3. Clonazione
    1. Electroporate 1 µ l della miscela legatura 20 µ l in 45 µ l di electrocompetent fatti in casa TOP10 Escherichia coli (protocolli correnti nella biologia molecolare, sezione 1.8.4-1.8.8). Immediatamente aggiungere 500 µ l di 2 X YT terreno ed incubare a bagnomaria a 37 ° C per 30 min. batteri diffusione trasformato su piastre di ampicillina YT: 2x. Incubare per una notte a 37 ° C.
    2. Per ogni trasformazione, schermo otto colonie mediante PCR.
      1. Impostare una premiscela di reazione come segue su ghiaccio: 45 µ l di tampone di PCR, 12 µ l di MgCl2 (25 mM), 4 µ l di dNTP (da un magazzino contenente 10 mM di ciascuno), 10 µ l di primer forward (magazzino 10 µM) ibridando alla sequenza di vettore (primer Ab-vec-senso): 5x e 10 µ l di primer reverse (magazzino 10 µM) targeting per la regione costante catena pesante o leggero (Vedi Tabella materiali per sequenze dell'iniettore). Portare a un volume finale di 200 µ l con H2O. Quindi aggiungere 4 µ l di enzima DNA polimerasi (5 U / µ l).
      2. Distribuire 25 µ l di premiscela di reazione per ogni provetta PCR 8-striscia sul ghiaccio.
      3. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere diverse colonie. Striscia lo stuzzicadenti su un piatto di ampicillina 2 x TY costituiscono un piatto di replicare e quindi immergerlo in una provetta di reazione di PCR.
      4. Eseguire lo screening PCR sotto le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 10 minuti, seguiti da 25 cicli di 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C e 50 s a 72 ° C.
      5. Identificare batteri positivi migrazione 5 µ l dei prodotti di PCR su un gel di agarosio al 1.5%.
        Nota: Colonie positivi danno un prodotto PCR circa 850 bp per il vettore di catena pesante e 600 bp per il vettore di catena leggera.
    3. Inoculare quattro colonie positive dalla piastra di replicare in 2 mL di terreno LB e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    4. Estrarre i plasmidi da colture liquide utilizzando un kit di purificazione del plasmide, come indicato dal produttore.
    5. Verificare il corretto inserimento dei domini variabili di Sanger sequenziamento dei plasmidi con il primer Ab-vec-senso.
      Nota: Plasmidi con l'inserto corretto (codifica l'HC e la corrispondente LC) devono essere cotransfected nelle cellule 293A per secrezione. La specificità della piccola scala-prodotto mAbs è analizzata da ELISA. Produzione su larga scala viene eseguito se applicabile.

6. produzione di anticorpi monoclonali

  1. Produzione su piccola scala per il controllo di specificità
    1. Il giorno prima la transfezione, rene embrionale umano seme 15.000 293A (HEK 293A) cellule in 200 µ l di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Incubare per una notte in un incubatore a CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A cellule in medium DMEM contenente 10% FBS usando un derivato di polyethylenimine lineare come reagente di transfezione.
      Nota: Eseguire la transfezione in triplici copie. Il seguente protocollo è per un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo piatto.
      1. Diluire 0,5 µ l di reagente di transfezione del DNA in 10 µ l di NaCl 150 mM. Diluire 0.125 µ g di vH e 0.125 µ g di vettori esprimenti vL in 10 µ l di NaCl 150 mM. Vortice ogni diluizione per 10 s.
      2. Aggiungere 10 µ l diluito reagente di transfezione del DNA nei 10 µ l di soluzione di DNA. Vortice 15 s e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere il mix di 20 µ l drop-wise sulle cellule 293A e miscelare agitando delicatamente la piastra.
    3. Sostituire il medio 16 h dopo trasfezione e cellule di cultura per 5 giorni in medium senza siero.
      Nota: Utilizzare medium senza siero per evitare siero Igs contaminando gli anticorpi prodotti.
    4. Eliminare le cellule e i detriti mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
    5. Raccogliere i surnatanti di aspirazione con una pipetta multicanale e trasferirli in un piatto fondo V 96 pozzetti.
    6. Cappotto Ag rilevanti durante la notte a 4 ° C in 100 µ l di rivestimento ELISA/ELISPOT ricostituito nel buffer 1x ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL in piastre da 96 pozzetti ELISA. Vedere esempi in 9.
    7. Blocco pozzi con il mezzo di FBS DMEM 10% per 2 ore a 37 ° C
    8. Aggiungere 50 µ l di surnatanti delle cellule trasfettate 293A dal punto 6.1.5 e incubare per 2 h a TA.
    9. Aggiungere 100 µ l di un essere anti-umano IgG Ab coniugato all'enzima perossidasi (HRP) rafano a 1 µ g/mL e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Aggiungere 50 µ l substrato cromogenico (TMB) e incubare per 20 minuti.
    10. Leggere la densità ottica a 450 nm in uno spettrofotometro.
      Nota: MAbs specifici ha rivelato mediante ELISA può essere prodotto ulteriore a larga scala e purificato proteina una colonna che presenta affinità per IgG umane.
  2. Produzione su larga scala e purificazione di anticorpi monoclonali specifici
    1. Il giorno prima la transfezione, seme 6 x 106 embrionali umane del rene 293A (HEK 293A) di celle in boccette di2 cm 175 contenente 25 mL DMEM supplementato con 10% FBS. Incubare per una notte in un incubatore a CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
      Nota: Le cellule dovrebbero essere 70% confluenti quando trasfettate.
    2. Cotransfect 293A cellule in medium DMEM contenente 10% FBS usando un derivato di polyethylenimine lineare come reagente di transfezione.
      1. Diluire 50 µ l di reagente di transfezione del DNA in 450 µ l di NaCl 150 mM. Diluire 10 µ g di vH e 10 µ g di vettori esprimenti vL in 500 µ l di NaCl 150 mM. Vortice 10 s ogni diluizione.
      2. Aggiungere alla soluzione di DNA diluito reagente di transfezione del DNA. Vortice 15 s e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere il mix di 1 mL drop-wise per le cellule e mescolare agitando delicatamente il pallone.
    3. Sostituire il medio 16 h dopo trasfezione e cellule di cultura per 5 giorni in medium senza siero.
    4. Raccolto medio aspirando con una pipetta 25 mL.
    5. Eliminare le cellule e i detriti mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
    6. Purificare gli anticorpi usando una colonna di 1 mL rivestita con proteina A in un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci a 4 ° C.
      1. Equilibrare la proteina una colonna sepharose con 20 mM di tampone fosfato (pH 7).
      2. Filtrare il mezzo di coltura cellulare da 6.2.5 utilizzando un filtro 1.22 µm, quindi un filtro da 0,45 µm.
      3. Caricare il mezzo filtrato sulla colonna.
      4. Lavare con 20 mM di tampone fosfato (pH 7) ed eluire con un tampone di citrato di 0.1 M (pH 3.5).
      5. Leggere la densità ottica a 280 nm in uno spettrofotometro di assorbimento e subito neutralizzare le frazioni contenenti proteine con 1 tampone Tris M (pH 9).
    7. Dializzare Ab purificata durante la notte a 4 ° C in una cassetta con un peso molecolare di 3,5 K taglio contro tampone PBS (pH 7,4).
    8. Sterilizzare in purezza di filtrazione e controllo di 0,2 µm mediante cromatografia di esclusione dimensionale, come indicato dal produttore.

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Risultati

A partire da PBMC da donatori sani, questo project presenta la generazione di anticorpi monoclonali umani, che riconoscono il peptide Pp65495 (Pp65, da citomegalovirus umano) presentata dalla classe complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) molecola HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Questi anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra questo complesso e complessi che rappresentano altri peptidi caricati su stesso MHC-ho molecola.

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Discussione

Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l'uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a flus...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la struttura Cytometry "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutto il personale di produzione di proteine ricombinanti (P2R) e di piattaforme di impatto (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Emmanuel Scotet e Richard Breathnach per commenti costruttivi sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto IHU-Cesti finanziato dal programma di governo francese «Investissements d'Avenir», gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Quest'opera è stata realizzata nell'ambito del programma LabEX IGO supportato dall'agenzia di ricerca nazionale tramite l'investimento del futuro programma ANR-11-LABX-0016-01.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEK 293A linea cellulareThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco di life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucosio
0,11g/L Piruvato di sodio
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Albumina sierica bovina (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Fosfato Soluzione Salina Tamponata (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Acido etilendiamminotetraacetico) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Siero fetale bovino (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - separazione dei linfociti medioEuroBioCMSMSL01-01densità 1,0777+/-0,001
streptavidina R-ficoeritrina coniugatoInvitrogen di Life TechnologiesS21388grado premiun 1mg/ml contiene 5mM di sodio azide
streptavidina, alloficocianina coniugatoInvitrogen di thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM azide di prima qualità
Brilliant violet 421 streptavidinaBiolegend405225conc : 0,5mg/ml
Microsfere magnetiche coniugate anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Microsfere magnetiche coniugate anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs o separatore QuadroMACSMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Diluizione usata 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Diluizione usata 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Diluizione usata 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Diluizione usata 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Diluizione usata 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter CitometroBD Biosciences
Provette PCR a 8 strisceAxygen321-10-061
Rack per 96 microprovetteDominique Dutscher45476
RNAseOUT Inibitore della ribonucleasi (ricombinante)Invitrogen di thermoFisher scientific10777-019qtà:5000U (40U/ul)
Acqua distillata Senza Dnase/RnasiGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Esameri casualiInvitrogen di thermoFisher scientificN8080127qtà: 50uM, 5nmoles
Superscript III Trascrittasi inversaInvitrogen di thermoFisher scientific18080-044qtà : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasiPromegaM7805
dNTP Set, grado di biologia molecolareThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane - Screening PCR di batteri
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer esterni -Primer inversi per Ig umane
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTCAGCTGGTGCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer diretti
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer in avanti
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni - Primer 5AgeIVH6_1
EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer diretti
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGTGACCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGTGGTGTG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene pesanti - Primer interni -Primer inversi
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti
5'LVk3EurofinsCTCTTCCCTCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer diretti
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni - Primer diretti
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer esterni -Primer inversi - Screening PCR batterico
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer in avanti
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
Secondo		ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni - Primer diretti
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere k - Primer interni -Primer diretti
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Forward primer
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Primer diretti
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Primo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer esterni -Forward primer
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - Primer in avanti
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni - primer in avanti
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Secondo ciclo di PCR - Amplificazione di catene leggere λ - Primer interni -Primer inversi - Screening PCR
batterico Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Screening PCR batterico
QA Agarose-TM, Molecular Biology GradeMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
Enzyme Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzima SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzima Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzima BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (numero di accesso Genbank FJ475055)
LCk (numero di accesso Genbank FJ475056
LCl (adesione Genbank numero FJ517647)
T4 DNA ligasiInvitrogen di thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT medioSigmaAldrich Y1003-500ML
AmpicillinaSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Brodo (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospin Plasmide DNA, RNA e per purificazione di proteineMacherey Nagel740588.250
Jet PEI Reagente per trasfezione DNAPolyPlus101-40
Fondo piattoPiastra a 96 pozzettiFalcon353072
Piastra a 96 pozzetti con fondo a VNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2 FlaconiNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT tampone di rivestimentoeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp fondo piatto 96 pozzetti Piastre ELISANunc/Thermofisher44-2404-21alto legame proteico
Anti-IgG umano Ab coniugato alla perossidasi di rafano (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
Substrato TMBBD Biosciences555214
StreptavidinaSigmaS0677
1 mL-HiTrap proteina A colonna HPGE Healthcare17-0402-01
Ä Colonna KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 PlusBioRad7880003
) Sistema cromatografico

Riferimenti

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
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  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
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  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
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  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
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Ristampe e permessi

Errata corrige


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

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