Articolo metodologico

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

DOI:

10.3791/56514

⸱

25 ottobre 2017

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1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, University of Cologne, 2Cologne Cluster of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Abstract

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Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Introduzione

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I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.

L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal m....

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Protocollo

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tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.

l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzion....

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Risultati

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Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente .......

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Discussione

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Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ottenu.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
EZ-Link NHS BiotinaThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
TUBICarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SaccarosioCarl Roth4621.1
MannitoloCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasiThermo Fisher Scientific1861280
Citocalasina BSigmaC6762
DYNAL o DynaMag MagneteThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpettrofotometroBio-Rad170-2501
Ansa batterica (10µ l)Sarstedt86.1562.010
Sierotipo di Salmonella enterica Typhimurium SL1344Istituto Leibniz DSMZ-Collezione tedesca di microrganismi e colture
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidina InvitrogenSA1011
anticorpo anti-beta-actinaSanta Cruz Biotechnologysc-47778
anticorpo anti-mCherryThermo Fisher ScientificPA5-34974
anticorpo anti-Rab5Santa Cruz Biotechnologysc-46692
anticorpo anti-Rab7Santa Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPasi (V0) anticorpoSanta CruzBiotechnology sc-28801
anticorpo anti-v-ATPasi (V1)Santa Cruz Biotechnologysc-20943
anticorpo anti-catepsina DSanta Cruz Biotechnologysc-6486
anticorpo anti-Tomm20Santa Cruz Biotechnologysc-17764
anticorpo anti-calnexinaSanta Cruz Biotechnologysc-46669
anticorpo anti-GAPDHSanta Cruz BiotechnologySC-20357
cellulari

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....

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