Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Summary

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Abstract

Uno degli obiettivi centro di mechanobiology è capire l'effetto reciproco di stress meccanico sulle cellule e proteine. Nonostante la sua importanza, l'influenza dello stress meccanico sulla funzione cellulare è ancora capito male. In parte, questa lacuna di conoscenza esiste perché alcuni strumenti attivare deformazione simultanea di tessuti e cellule, imaging di attività cellulare negli animali vivi ed efficiente limitazione della motilità in organismi modello altrimenti altamente mobile, come il nematode Caenorhabditis elegans. Le piccole dimensioni di c. elegans li rendono un'eccellente corrispondenza ai dispositivi di ricerca basata su microfluidica, e soluzioni per l'immobilizzazione sono stati presentati utilizzando dispositivi microfluidici. Anche se questi dispositivi consentono l'imaging ad alta risoluzione, l'animale è completamente racchiuso in polidimetilsilossano (PDMS) e vetro, limitando l'accesso fisico per la consegna di forza meccanica o registrazioni elettrofisiologiche. Recentemente, abbiamo creato un dispositivo che integra attuatori pneumatici con un disegno di intrappolamento che è compatibile con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Il canale di azionamento è separato dal canale di registrazione di vite senza fine da una sottile membrana PDMS. Questa membrana è deviato sul fianco di un verme applicando pressione da un'origine esterna. Il dispositivo può indirizzare mechanosensitive singoli neuroni. L'attivazione di questi neuroni è ripreso in alta risoluzione con indicatori di calcio geneticamente codificato. Questo articolo presenta il metodo generale usando ceppi di c. elegans esprimendo indicatore attività calcio-sensibile (GCaMP6s) nel loro neuroni recettori di tocco (TRNs). Il metodo, tuttavia, non è limitato a TRNs né ai sensori di calcio come una sonda, ma può essere esteso ad altre cellule sensibili meccanicamente o sensori.

Introduction

Il senso del tatto fornisce animali con informazioni cruciali per il loro ambiente. A seconda della forza applicata, tocco è percepito come innocuo, piacevole o doloroso. La deformazione del tessuto durante il tocco viene rilevata da cellule specializzate Meccanocettore incorporate nella pelle che esprimono proteine recettoriali, più comunemente i canali ionici. I passaggi che collegano percezione della forza di attivazione dei canali ionici durante il tocco e il dolore completamente non sono capiti. Ancor meno è conosciuto circa come il tessuto della pelle filtri deformazione meccanica e se meccanorecettori per rilevare le modifiche nel ceppo o stress

Protocol

1. fabbricazione di dispositivi

1. Scaricare il file di maschera (Supplemental File 1) e generare una maschera di chrome utilizzando un servizio commerciale o in-House. Come la dimensione più piccola del dispositivo è di 10 µm (spessore della membrana attuatore), assicurarsi che la maschera sia sufficientemente alta risoluzione, entro ± 0.25 µm, per produrre in modo affidabile le caratteristiche.
2. Seguire metodi di fotolitografia SU-8 standard (ad esempio, fa riferimento a^24,25,26) per fabbri....

Results

Litografia SU-8 e Chip Bonding
Il protocollo di litografia e stampaggio PDMS seguire le procedure standard. Dettagli possono essere trovati altrove^23,24,25,26. Il PDMS dovrebbe staccare la cialda senza problemi dopo l'indurimento. Se le caratteristiche di SU-8 strappare durante il peeling PDMS, o lo strato di adesione SU-8 o la silanizzazione.......

Discussion

Questo protocollo viene illustrato un metodo per la consegna precisa stimolazione meccanica per la pelle di un verme intrappolato in un chip microfluidico. Esso è destinato a facilitare l'integrazione di stimoli fisici per rispondere alle domande biologiche e mira a snellire mechanobiology ricerca nei laboratori biologici. Questo metodo estende precedenti saggi per valutare la funzione dei neuroni che mechanosensory in c. elegans. Tecniche quantitative e semi-quantitativa precedenti misurato le forze

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Maschera cromata	Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)		5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Maschera cromata	Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)		5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Mascherina cromata	Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/		5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Wafer di silicio da 4 '' (B-test)	Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002	MicroChem
SU-8 2050	MicroChem
Spin-coater	Laurell Technologies	WS-400BZ-6NPP / LITE
Timer di esposizione	Optical Associates, Inc	OAI 150
Controller	di illuminazioneOptical Associates, Inc	2105C2
SU-8 sviluppatore	MicroChem
2-propanolo	Fisher Scientific	A426F-1GAL
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
triclorometilsilano (TCMS)	Sigma-Aldrich	92361-500ML	Attenzione: TCMS è tossico e reattivo all'acqua
Sylgard 184 Elastomero Kit	Dow Punzone	in prepolimero
, 1 mm	VWR	95039-090
Oxygen Plasma Asher	Branson/IPC
Piccolo tubo metallico (0,635 mm OD, 0,4318 mm ID, 12,7 mm di lunghezza); misura del calibro 23TW	New England Small Tube Corporation	NE-1300-01
Filtro per siringa Nalgene, 0,22 μ m	Thermo Scientific	725-2520	per filtrare tutta la soluzione, piccole particelle ostruirebbero il chip
Tubo in polietilene; 0,9652 mm OD, 0,5842 mm ID	Siringa Solomon Scientific	BPE-T50
, 1 ml	BD Scientific	per l'intrappolamento e il rilascio
vermi, 20 ml	BD Scientific	309661	per flusso gravitazionale
Gilson Minipuls 3, peristaltico	pompa Gilson		per aspirare soluzioni e vermi dal chip
Regolatore di flusso microfluidico, dotato di 0– Canale di pressione da 800 kPa	Uscita di pressione	Elveflow	OB1 MK3
Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 4 mm e diametro esterno di 6 mm	Collegamento McMaster-Carr	5195 T52	dall'aria domestica alla pompa a pressione
Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 2,6 mm e diametro esterno di 4 mm	McMaster-Carr	5195 T51	collega la pompa a pressione a un tubo piccolo
Raccordo per tubo push-to-connect per aria	McMaster-Carr	5111K468	metrico - convertitore imperiale
Connettore diritto per 6 mm × 1/4″ Tubo OD	McMaster-Carr	5779 K258
Sistema di microscopia Leica DMI 4000 B	Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO obiettivo olio	Leica	506081
Hamamatsu Fotocamera CMOS digitale Orca-Flash 4.0LT	Hamamatsu	C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine	Lumencor		Con sorgente luminosa ciano e verde/giallo
Divisore di fascio di eccitazione	Chroma	59022bs	al microscopio
Hamamatsu W-view Gemini Ottica di divisione delle immagini	Hamamatsu	A12801-01	per dividere l'emissione verde e rossa e proiettarle su diverse aree del chip della fotocamera
Divisore di fascio di emissione	Chroma	T570lpxr	nel divisore di immagini
Filtri di emissione GCamp6s	Chroma	ET525/50m	nello splitter di immagini
Filtri di emissione mCherry	Chroma	ET632/60m	nello splitter di immagini