Method Article

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

DOI:

10.3791/56530

⸱

February 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Abstract

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Uno degli obiettivi centro di mechanobiology è capire l'effetto reciproco di stress meccanico sulle cellule e proteine. Nonostante la sua importanza, l'influenza dello stress meccanico sulla funzione cellulare è ancora capito male. In parte, questa lacuna di conoscenza esiste perché alcuni strumenti attivare deformazione simultanea di tessuti e cellule, imaging di attività cellulare negli animali vivi ed efficiente limitazione della motilità in organismi modello altrimenti altamente mobile, come il nematode Caenorhabditis elegans. Le piccole dimensioni di c. elegans li rendono un'eccellente corrispondenza ai dispositivi di ricerca basata su microfluidica, e soluzioni per l'immobilizzazione sono stati presentati utilizzando dispositivi microfluidici. Anche se questi dispositivi consentono l'imaging ad alta risoluzione, l'animale è completamente racchiuso in polidimetilsilossano (PDMS) e vetro, limitando l'accesso fisico per la consegna di forza meccanica o registrazioni elettrofisiologiche. Recentemente, abbiamo creato un dispositivo che integra attuatori pneumatici con un disegno di intrappolamento che è compatibile con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Il canale di azionamento è separato dal canale di registrazione di vite senza fine da una sottile membrana PDMS. Questa membrana è deviato sul fianco di un verme applicando pressione da un'origine esterna. Il dispositivo può indirizzare mechanosensitive singoli neuroni. L'attivazione di questi neuroni è ripreso in alta risoluzione con indicatori di calcio geneticamente codificato. Questo articolo presenta il metodo generale usando ceppi di c. elegans esprimendo indicatore attività calcio-sensibile (GCaMP6s) nel loro neuroni recettori di tocco (TRNs). Il metodo, tuttavia, non è limitato a TRNs né ai sensori di calcio come una sonda, ma può essere esteso ad altre cellule sensibili meccanicamente o sensori.

Introduction

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Il senso del tatto fornisce animali con informazioni cruciali per il loro ambiente. A seconda della forza applicata, tocco è percepito come innocuo, piacevole o doloroso. La deformazione del tessuto durante il tocco viene rilevata da cellule specializzate Meccanocettore incorporate nella pelle che esprimono proteine recettoriali, più comunemente i canali ionici. I passaggi che collegano percezione della forza di attivazione dei canali ionici durante il tocco e il dolore completamente non sono capiti. Ancor meno è conosciuto circa come il tessuto della pelle filtri deformazione meccanica e se meccanorecettori per rilevare le modifiche nel ceppo o stress1,2,3. Questo scarto nella comprensione deriva, in parte, da una mancanza di strumenti adeguati per applicare precise stimolazioni meccaniche sulla superficie della pelle di un animale vivente osservando le risposte a livello cellulare. Considerando che la microscopia a forza atomica è stata usata estesamente per applicare e misurare le forze in cellule isolate4,5 e anche per attivare recettori Piezo1 in vita cellule6, esperimenti simili utilizzando animali viventi, soprattutto C. elegans, sono stati notoriamente impegnativo a causa della mobilità intrinseca del soggetto. Questa sfida è tradizionalmente aggirata utilizzando colla del cianoacrilato veterinaria - o -grado chirurgico per immobilizzare i singoli animali agar pastiglie1,7,8,9. Questo approccio è stato produttivo, ma ha limitazioni legate all'abilità necessaria per immobilizzazione di incollaggio e la superficie di agar molle su fattori meccanici. Una strategia di microfluidica è un'alternativa gratuita che consente di evitare alcune delle complicazioni legate a incollaggio.

Il nematode c. elegans è un organismo modello genetico con un sistema nervoso completamente mappato che, a causa delle dimensioni dell'animale, è una buona misura per la tecnologia microfluidica. Offerta di dispositivi basati su microfluidica il vantaggio che gli animali altrimenti estremamente mobili possono essere trattenuti durante l'esecuzione di imaging ad alta risoluzione e la consegna di stimoli neuro-modulatori rilevanti. Con l'aiuto di microfluidica tecnologie, animali viventi possono essere immobilizzati senza danno10,11, consentendo il monitoraggio di attività comportamentali sopra l'intero ciclo di vita12,13 e ad alta risoluzione Imaging di attività neuronale14,15,16,17. Ulteriormente, molti neuroni Meccanocettore necessari per il senso del tatto e dolore può essere caratterizzato il loro fisiologico1,8, meccanico4,18,19e molecolare livello20,21,22.

C. elegans sensi dolci stimoli meccanici alla sua parete di corpo usando sei TRNs, tre dei quali innervano l'animale anteriore (ALML/R e AVM) e tre delle quali innervano posteriore dell'animale (PLML/R e PVM). Le molecole di canale di ioni necessari per trasdurre una forza applicata in un segnale biochimico sono state studiate estesamente in suoi TRNs8. Questo articolo presenta una piattaforma di microfluidica23 che consente ai ricercatori di applicare forze meccaniche precisione sulla pelle di un immobilizzato c. elegans ascaridi, durante la lettura fuori la deformazione dei suoi tessuti interni di imaging ottico. Oltre a presentare ben definiti stimoli meccanici, transienti di calcio possono essere registrate in neuroni di Meccanocettore con risoluzione subcellulare e correlati con caratteristiche morfologiche e anatomiche. Il dispositivo è costituito da un canale centrale dell'intrappolamento che contiene un singolo animale e presenta la sua pelle accanto a sei canali di azionamento pneumatico (Figura 1 e Figura 2). I sei canali sono posizionati lungo il canale di registrazione dei colori per fornire stimoli meccanici a ciascuna delle sei TRNs del verme. Questi canali sono separati dalla camera di intrappolamento da sottili diaframmi PDMS, che possono essere azionati da una sorgente di pressione dell'aria esterna (Figura 1). Abbiamo calibrato la deviazione rispetto alla pressione e fornire le misure in questo articolo. Ogni attuatore può essere indirizzato singolarmente e usato per stimolare un Meccanocettore di scelta. La pressione viene recapitata tramite una pompa di pressione piezo-driven, ma può essere usato qualunque dispositivo alternativo. Indichiamo che il protocollo di pressione può essere utilizzato per attivare TRNs in vivo e dimostrare dispositivi di azionamento adatta per fornire stimoli meccanici per adulti di c. elegans, caricamento di animali adulti in dispositivi, esecuzione di formazione immagine del calcio esperimenti e analisi dei risultati. Fabbricazione di dispositivi è costituito da due fasi principali: 1) fotolitografia per fare uno stampo da SU-8; e 2) stampaggio PDMS per rendere un dispositivo. Per ragioni di brevità e chiarezza, i lettori sono indicati precedentemente pubblicati articoli e protocolli24,25 per istruzioni su come produrre le muffe e i dispositivi.

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Protocol

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1. fabbricazione di dispositivi

  1. Scaricare il file di maschera (Supplemental File 1) e generare una maschera di chrome utilizzando un servizio commerciale o in-House. Come la dimensione più piccola del dispositivo è di 10 µm (spessore della membrana attuatore), assicurarsi che la maschera sia sufficientemente alta risoluzione, entro ± 0.25 µm, per produrre in modo affidabile le caratteristiche.
  2. Seguire metodi di fotolitografia SU-8 standard (ad esempio, fa riferimento a24,25,26) per fabbricare lo stampo per la successiva produzione di dispositivi PDMS; un riepilogo dei passaggi è elencato di seguito.
    Nota: SU-8 è un materiale fotosensibile, quali legami incrociati sull'esposizione a luce ultravioletta (assorbimento massimo ~ 365 nm). Utilizzare le istruzioni del produttore come punto di partenza per determinare i parametri di elaborazione per il soft-cuoce, esposizione (UV) e post-cuocere.
    1. Depositare SU-8 2002 su un wafer di silicio e spin-cappotto per uno spessore approssimativo di 2 µm, per una migliore adesione delle piccole strutture. Soft-cuoce su una piastra calda per 1 min a 95 ° C, leggermente sovra-esporre (UV) l'intera superficie (~ 100 mJ/cm2) e post-cuocere su una piastra calda per 2 min a 95 ° C.
    2. Spin-cappotto uno strato spesso di 47-µm di SU-8 2050 per definire le caratteristiche del dispositivo. Utilizzare una velocità di centrifuga di 500 giri/min per 15 s (accelerazione 130 giri/s) e poi 2.000 giri/min per 90 s (accelerazione 260 giri/min/s). Se necessario, ripetere e regolare la velocità di centrifuga per ottenere lo spessore corretto del photoresist.
    3. Soft-cuocere su una piastra calda per 2 min a 65 ° C e poi per 7 min a 95 ° C. Esporre il photoresist secondo le istruzioni del produttore (~ 160 mJ/cm2) usando un filtro di maschera e long-pass di cromo per assicurare muri laterali diritte.
    4. Rimuovere la cialda e post-cuocere su una piastra calda per 1 min a 65 ° C e per 7 min a 95 ° C.
    5. Sciogliere non esposti SU-8 con developer e pulire con 2-propanolo.
    6. Cuocere in forno la cialda su una piastra riscaldante a 180 ° C per 30 min (duro-cuocia) stabilizzare il photoresist caratteristiche.
  3. Effettuare una replica PDMS dal modello SU-8 utilizzando standard replica metodi27di stampaggio.
    1. Trattare la muffa SU-8 con trichloromethylsilane (TCMS) del vapore per ridurre l'adesione PDMS (silanizzazione).
      Attenzione: TCMS è acqua-reattivi e tossici.
      1. Posizionare la cialda modellata in una griglia di wafer all'interno di un essiccatore di vuoto di campana di vetro in una cappa priva di acqua o reagenti solubili in acqua.
      2. Sotto il cofano, utilizzare un contagocce per applicare 1 goccia di TCMS per un piatto di vetro e posto all'interno di un essiccatore.
      3. Chiudere il coperchio di un essiccatore e consente la TCMS vapore rivestire la cialda per almeno 20 min.
      4. Sfiato e quindi aprire un essiccatore. Aprire il coperchio campana di vetro e rimuovere la cialda utilizzando pinzette in plastica. Posto in una barca di lamina Petri o alluminio per lo stampaggio di replica PDMS. Smaltire materiali rivestiti TCMS nel corretta dei rifiuti pericolosi.
    2. PDMS mix (rapporto 10:1) con 40 g di base polimero e 4G PDMS agente indurente.
    3. Versare il composto sopra lo stampo SU-8 e degassare la miscela per almeno 30 min in una camera a vuoto.
    4. Cura per almeno 6 ore a 70 ° C in un forno.
  4. Sollevare la cialda PDMS impostando la cialda orizzontale su una superficie piana e staccando accuratamente il PDMS. Non piegare il wafer verso l'alto durante questo passaggio, perchè si può rompere lo stampo.
    Nota: Adesione incompleta di SU-8 per la cialda o silanizzazione incompleta può provocare la distruzione delle strutture SU-8 durante questo passaggio.
  5. Tagliare PDMS intorno i dispositivi su integrati tali che i dispositivi si adattano su un vetrino coprioggetto 24 x 60 mm.
  6. Usando un punzone per biopsia 1 mm, bucare l'ingresso, le due prese e sei attuatori usando un punzone per biopsia di 1 mm. Obiettivo per i 2 mm di diametro cerchi intorno ai bordi del dispositivo.
  7. Bond PDMS chip di vetro vetrini coprioggetto.
    1. Esporre entrambe le superfici per il plasma ad ossigeno 80 W (30 s).
    2. Posizionare delicatamente la superficie PDMS esposta sulla superficie esposta di vetrini coprioggetto per una tenuta conformal.
    3. Tempri la periferica su una piastra calda (100 ° C, 10 min).
      Nota: Incollaggio insufficiente può portare al fallimento del dispositivo a causa di perdite.

2. preparazione del microscopio

Nota: Gli animali transgenici: esprimere un indicatore del calcio come GCaMP6s28 o altra sonda attività geneticamente codificato in neuron(s) di interesse (ad es., TRN); co-esprimono una proteina fluorescente di attività indipendente che emette una lunghezza d'onda diverse per correggere la piccola laterale e artefatti di movimento di out-of-focus che sorgono a causa di stimolazione meccanica. Il software di analisi automatizzata canzoni e compensa le variazioni di movimento-indotto nell'intensità della sonda attività. Il worm ceppi GN69223 (o AQ323629) express GCaMP6s (o GCaMP6m) e il tagRFP di calcio-indipendente sotto il controllo del promotore di mec-7. Inoltre, GN692 contiene la mutazione lite-1(ce314), che impedisce l'attivazione di TRNs a causa del sensore di luce blu lite-130 durante l'eccitazione della fluorescenza GCaMP6s23.

  1. Impostare un sistema di microscopio per eccitazione simultanea di GCaMP e RFP.
    1. Utilizzare una sorgente di luce continua e un filtro di eccitazione di dual-band che trasmette la luce solo ciano e gialla, o utilizzare una sorgente di luce che emette solo lunghezze d'onda in una larghezza di banda definita come ciano simultanea (0,77 mW) e giallo (1,21 mW) LED sorgenti di eccitazione per simultanea eccitazione della fluorescenza calcio-dipendenti e indipendente, rispettivamente.
    2. Utilizzare una fotocamera digitale per consentire la registrazione di immagini di microscopia.
      Nota: La maggior parte delle fotocamere sono dotate di un software per l'acquisizione di immagini. In alternativa, ci sono software liberamente disponibile che può essere utilizzato per controllare la fotocamera e potenzialmente anche altre parti del sistema di microscopia.
    3. Regolare l'intensità di eccitazione basato sull'intensità di fluorescenza per evitare saturazione fotocamera.
  2. Utilizzare un cubo di fluorescenza che a seconda della scelta della sorgente di eccitazione deve essere dotato di un filtro di eccitazione.
    Nota: Un GFP 488 nm e 580 nm mCherry filtro di eccitazione è stata usata qui.
    1. Aggiungere un beam splitter al cubo per riflettere la luce ciano e gialla e trasmissione della luce verde e rossa.
    2. Dotare il microscopio con un 10x obiettivo e un obiettivo ad alto ingrandimento (ad es., 63 X / 1,32 olio NA) per concentrare la luce sul campione di eccitazione.
  3. Montare un divisore di fascio davanti alla telecamera per la registrazione simultanea del GCaMP e il segnale del calcio-indipendente. Garantire che il divisore di fascio ha uno specchio dicroico (passaggio lungo, cut-off a 570 nm) per separare la luce verde e rossa, utilizzando un filtro di emissione per il verde (banda passante centrata a 525 nm con larghezza di 50 nm) e filtro di una emissione di luce rossa (banda passante centrata a 632 nm con 60 nm larghezza).
  4. Fluorescenza verde e rosso sulla parte superiore del progetto (verde) e metà inferiore (rosso), rispettivamente della fotocamera chip (Vedi Figura 3). Questo orientamento è un prerequisito per il software di analisi fornito.

3. animale preparazione

  1. Preparare sincronizzati in età giovane adulto o adulto giorno uno di c. elegans, come descritto in precedenza da Porta-de-la-Riva et al. 31
  2. Preparare il chip microfluidici.
    1. Collegare il serbatoio di flusso di gravità (~ 60 cm sopra il livello del chip) contenente filtrata (filtro per siringa da 0,2 µm in polietersulfone) M9 buffer per una presa del chip. Collegare l'altra presa a una presa di un contenitore per rifiuti due-presa, vale a dire, una beuta per filtrazione. Collegare l'altra presa del contenitore dei rifiuti ad una pompa peristaltica.
      Nota: Utilizzare tubi di polietilene (PE) per tutte le connessioni e metal raccordi tubo per collegare i tubi di PE al chip. In questo modo tutte le soluzioni dei rifiuti saranno lavate fuori il chip e raccolto nel contenitore dei rifiuti. Il flusso attraverso i canali di scarico crea una leggera aspirazione che manterrà il worm aderente durante il successivo processo di intrappolamento.
    2. Preparare interconnessioni che consiste di 50 mm lungo PE tubi (0.9652-mm OD, ID 0.5842 mm) con tubi di metallo (calibro dimensione 23TW, 0,635 mm di diametro) su entrambe le estremità. Press-fit queste interconnessioni in ciascuna delle sei dita di azionamento e nell'ingresso del vite senza fine (Vedi Figura 1). Lasciare queste interconnessioni nel chip, come rimozione ripetuta conduce da indossare sui fori PDMS.
  3. Posizionare il chip sul microscopio. Pick 2 – 5 vermi in una goccia di filtrato buffer M9 (filtro per siringa da 0,2 µm) e utilizzano una siringa da 1 mL per aspirare la loro in un tubo di PE (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) collegato ad una siringa 1 mL tirando delicatamente lo stantuffo. Tenere gli animali nel tubo PE e non nella siringa.
    Nota: Troppi vermi o soluzioni non filtrati nel chip possono portare all'occlusione.
  4. Collegare i tubi di PE della siringa per l'interconnessione all'ingresso della vite senza fine (Figura 1 e Figura 2) del chip. Attivare il flusso di gravità aprendo la valvola e avviare la pompa peristaltica. Quindi premere delicatamente lo stantuffo della siringa per spostare gli animali nel canale di intrappolamento osservando il canale sotto un microscopio con un obiettivo 10x in modalità campo chiaro.
    Nota: Occasionalmente-comparenti bolle d'aria non pongono un problema; vengono automaticamente spostati nella presa. Molti animali possono essere 'parcheggiati' nella camera di attesa e utilizzati in sequenza.
    1. Dopo aver caricato l'animale nel canale di intrappolamento (Vedi anche Figura 2), regolare la sua posizione delicatamente spingendo o tirando lo stantuffo della siringa per posizionare la testa dell'animale in forma affusolata della parte anteriore del canale.
    2. Assicurarsi che la vite senza fine (1 giorno adulto) ha le dimensioni giuste per essere intrappolati nel chip.
      1. Se il worm non riempie l'intera sezione trasversale del canale dal naso alla vicino alla fine del corpo (non compresa la punta della coda) o il worm si muove lungo l'asse del canale senza muovere lo stantuffo della siringa , rimuovere il worm premendo lo stantuffo della siringa fino a scomparire dal canale dell'intrappolamento e caricare una nuova (Vedi punto 3.8).
    3. Passare alla modalità di fluorescenza del microscopio e una lente di ingrandimento maggiore (40 X o superiore) e verifica se la neurite del neurone di interesse arriva a mentire attraverso il diaframma di uno degli attuatori. In caso contrario, regolare la posizione dell'animale tirando o spingendo lo stantuffo. Se questo non risolve il problema, rimuovere il worm e caricarne uno nuovo.
  5. Concentrarsi sul corpo cellulare del neurone di interesse e collegare l'interconnessione dell'attuatore più vicino al neurone sul lato anteriore del corpo cellulare a una pompa di pressione programmabile utilizzando tubi di PE.
    1. Se l'esperimento richiede che misura la distanza tra l'attuatore e il neurone, spostare il campo di vista, quindi sono entrambe nel campo visivo e la channelwall è parallela al bordo superiore e inferiore dell'immagine.
  6. Definire un protocollo di pressione con la pompa di pressione programmabile.
    Nota: Questo protocollo può essere regolato per l'esperimento desiderata.
    1. Iniziare con una pressione costante di 0 kPa per il tempo corrispondente ad almeno 50 immagini della sequenza di immagini (necessaria per la normalizzazione). Per un tasso di formazione immagine di 10 Hz questo corrisponde a 5 s. Aggiungi una forma d'onda desiderata stimolo e pressione e definire la lunghezza dello stimolo in una seconda fase.
      Nota: Per stimolare la TRNs, forma d'onda sinusoidale (cioè, 75 kPa, 10 Hz) sovrapposto con un passo (cioè, 275 kPa) è consigliabile che genera una grande risposta neuronale.
    2. Se l'esperimento richiede ulteriori stimoli, comprendono un periodo di almeno 10 s a pressione costante di 0 kPa tra stimoli. Prima di accendere la pompa di pressione, assicurarsi che la pressione dello strumento è a costante 0 kPa per evitare la stimolazione accidentale del worm prima l'esperimento vero e proprio.
  7. Eseguire il protocollo di imaging e pressione.
    1. Nel software di acquisizione di immagine della fotocamera, è possibile impostare una sequenza di immagini a 10 Hz, utilizzando un tempo di esposizione di 100 ms per tutta la durata del protocollo pressione. Regolare l'intensità di eccitazione tale che l'aumento di fluorescenza massima non saturare la fotocamera. Salvare le immagini come file *. TIF con almeno 50 immagini prima il primo stimolo per la normalizzazione.
    2. Avviare il protocollo di formazione immagine nel software di acquisizione immagini e il protocollo di pressione nel software della pompa programmabile. Durante la registrazione, osservare se il neurone di interesse è il punto più chiaro in un'area di 10x10 pixel, non si sposta più lontano di 10 pixel in immagini sequenziali e rimane nel campo visivo durante la registrazione.
      Nota: Se ciò non avviene, il software di analisi avrà esito negativo. Punti luminosi (cioè, autofluorescence) intorno il neurone fare pulire registrazioni dei neuroni difficile. Per risolvere il problema, rimuovere il worm dalla trappola e caricare un nuovo worm nel chip. Se il worm si muove troppo, provare una nuova registrazione del worm stesso e osservare il movimento della vite senza fine. Se il problema persiste il worm potrebbe essere troppo piccolo per essere intrappolati. In questo caso, rimuovere questo worm e caricare un verme leggermente più grande nella trappola.
    3. Se lo si desidera, registrare segnali da più neuroni nel campo di vista contemporaneamente fino a quando i neuroni sono separati da almeno 10 pixel durante l'intera registrazione.
    4. Per studiare l'assuefazione, eseguire ripetutamente l'esperimento su un animale.
  8. Rimuovere il worm dal canale dell'intrappolamento.
    1. Se si desidera mantenere il worm per studi successivi, scollegare le prese del chip verso il flusso di gravità ed il contenitore dei rifiuti. Premere delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando il verme intero viene spinto attraverso il canale di intrappolamento nella scanalatura del flusso.
    2. Continuare a premere lo stantuffo della siringa fino a che l'animale appare una goccia fuori del circuito integrato. Staccare la siringa tra cui i tubi di PE dall'ingresso di verme, usarlo per aspirare i vermi nella goccia e trasferirlo su una piastra di agar.
    3. Se non si desidera mantenere il verme, rimuovere il worm premendo lo stantuffo della siringa fino a quando il verme intero viene spinto attraverso il canale di intrappolamento nella scanalatura del flusso; il flusso di gravità e l'aspirazione della pompa peristaltica porterà l'animale fuori il chip e nel contenitore per rifiuti.

4. analisi

  1. Scaricare e installare la più recente versione di Fiji32.
  2. Scaricare e installare la versione SDK più recente di java.
    Nota: Se necessario, eliminare o rinominare la cartella di java all'interno della cartella di Fiji per Fiji utilizzare il compilatore java appena installato.
  3. Software Open di Fiji.
    1. Verificare se il software è in esecuzione il compilatore java appena installato aprendo ' plugin | Programmi di utilità | ImageJ | Proprieta.
  4. Scaricare il file pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, vedere complementare File 2).
  5. Trascinare e rilasciare i file. Java nella finestra del software per aprirlo come un plugin.
  6. Compilare ed eseguire il file pokinganalyzer*.java premendo i tasti Ctrl + R nelle Isole Figi; un'interfaccia utente grafica (frugando Analyzer) si aprirà (Figura 3).
    1. Fare clic sulla scheda "Help" e leggi i requisiti del software e come eseguire l'analisi. Per iniziare, selezionare la scheda "Open video" specificare il percorso del file video per l'analizzatore: fare clic sul pulsante "Aprire un Video", passare alla posizione del video e aprirlo.
      Nota: Il software viene avviato con questa scheda aperta. Se non è aperto quando si avvia una nuova analisi fare clic sulla scheda "Open video". Se il video è in formato a.tif, il programma internamente aprire il video e visualizzare la prima immagine nella parte inferiore dell'interfaccia. Se l'immagine non è del video che deve essere analizzato, fare clic sul pulsante "Apri un video" per aprire un altro video.
    2. Per continuare, fare clic sulla scheda "Definire ROIs". In questa scheda, definire la posizione della TRN. Si noti che la prima immagine del video aperto viene visualizzata nella parte inferiore di questa scheda, fare clic sul pulsante "Definire TRN" e scegliere il neurone nella parte superiore dell'immagine che dovrebbe mostrare la fluorescenza di GCaMP.
    3. Facoltativo: Se l'attuatore è visibile nella parte superiore dell'immagine il programma può automaticamente traccia la distanza tra il neurone e l'attuatore se lo si desidera. Per questo, controllare la "Definisci l'attuatore?" -casella, fare clic sul pulsante "Definire attuatore" e fare clic sull'attuatore nella metà superiore dell'immagine.
    4. Fare clic sulla scheda "Analisi" Definisci la frequenza di acquisizione immagine. Immettere un numero nel campo o fa clic sull'alto o verso il basso per aumentare o diminuire il numero. Se nella scheda precedente la "Definisci l'attuatore?" -casella è spuntata, definire le dimensioni della cella di fotocamera, l'ingrandimento e il fattore di binning, così il programma può calcolare la distanza.
    5. Fare clic sul pulsante "Avvia analisi".
      Nota: Il programma ora terrà traccia il neurone dalla relativa fluorescenza nella sequenza di immagine nella metà superiore (calcio-dipendente) e nella metà inferiore (calcio indipendente) della sequenza di immagini. Per compensare il movimento del neurone nel piano della registrazione del programma indagherà un'area di 10x10 pixel intorno alla posizione del neurone nell'immagine precedente per individuare la posizione del neurone nell'immagine seguente. Calcolerà la fluorescenza in entrambi i tempi di correzione per la fluorescenza di fondo (Fbg) e dividendo per la fluorescenza nelle prime 50 immagini (F0):
      figure-protocol-1
      Modifiche di fluorescenza nel canale verde, attività-dipendente (FCa2 +) che sono causate dal neurone di moto fuori dall'aereo di ricodifica sono poi corretto usando la fluorescenza nel canale rosso, attività indipendente (F corr) e la deviazione standard di pre-stimolo di calcio-dipendente (sdCa2 +) e fluorescenza indipendente (sdcorr) da:
      figure-protocol-2
    6. Il programma mostrerà lo stato di avanzamento nella barra di stato nella parte inferiore dell'interfaccia; Quando la barra di stato raggiunge il 100%, fare clic sulla scheda "Risultati". Se la barra di stato si interrompe prima 100%, il programma darà un messaggio di errore che indica il motivo che il programma non è stato in grado di analizzare il video.
      1. Se il rapporto segnale-rumore è troppo basso, il programma non è possibile identificare il neurone; regolare i parametri di imaging nelle registrazioni successive.
      2. Se il neurone lascia il campo di vista durante la registrazione, il programma non può tenere traccia piu ' e si fermerà. Per registrazioni successive, posizionare il neurone nel mezzo del campo di vista all'inizio della registrazione.
      3. Se alcune regioni nel campo visivo sono troppo saturi, l'analisi automatizzata produrrà risultati non validi. Per registrazioni successive, assicurarsi che il segnale di fluorescenza non saturare il sensore della fotocamera.
    7. Nella scheda 'risultati', il risultato viene visualizzato nella parte superiore. Salvare un file *. txt separato da tabulazione della tabella risultato cliccando su "Salva la tabella di risultato".
      Nota: Questa tabella è costituito dal tempo in secondi e la fluorescenza normalizzata di calcio-dipendente (rettificato dalla fluorescenza di calcio-indipendente). Se precedentemente definiti, contiene anche la distanza totale tra il TRN e l'attuatore in µm e la distanza tra il TRN e l'attuatore perpendicolare alla parete del canale in µm. risultati rappresentativi dell'intensità di fluorescenza aumentano dopo stimolazione in funzione della distanza del corpo cellulare all'attuatore più tracciati in Figura 4.
    8. Se esistono più neuroni in una registrazione (separata da più di 10 pixel), fare clic sulla scheda "Definire ROIs" nuovamente e tornare al punto 4.6.2 con il secondo neurone.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Litografia SU-8 e Chip Bonding
Il protocollo di litografia e stampaggio PDMS seguire le procedure standard. Dettagli possono essere trovati altrove23,24,25,26. Il PDMS dovrebbe staccare la cialda senza problemi dopo l'indurimento. Se le caratteristiche di SU-8 strappare durante il peeling PDMS, o lo strato di adesione SU-8 o la silanizzazione...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo viene illustrato un metodo per la consegna precisa stimolazione meccanica per la pelle di un verme intrappolato in un chip microfluidico. Esso è destinato a facilitare l'integrazione di stimoli fisici per rispondere alle domande biologiche e mira a snellire mechanobiology ricerca nei laboratori biologici. Questo metodo estende precedenti saggi per valutare la funzione dei neuroni che mechanosensory in c. elegans. Tecniche quantitative e semi-quantitativa precedenti misurato le forze

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli di Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez per supporto nella progettazione del dispositivo e della generazione di animali mutanti. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R01EB006745 (di BLP), R01NS092099 (di MBG), K99NS089942 (per MK), F31NS100318 (per ALN) e ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito dell'Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma ( Convenzione n. 715243 di sovvenzione MK).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Maschera cromataCompugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Maschera cromataMitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Mascherina cromataKuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Wafer di silicio da 4 '' (B-test)Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
Spin-coaterLaurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP / LITE
Timer di esposizioneOptical Associates, IncOAI 150
Controllerdi illuminazioneOptical Associates, Inc2105C2
SU-8 sviluppatoreMicroChem
2-propanoloFisher ScientificA426F-1GAL
AcetoneFisher ScientificA18-4
triclorometilsilano (TCMS)Sigma-Aldrich92361-500MLAttenzione: TCMS è tossico e reattivo all'acqua
Sylgard 184 Elastomero KitDow Punzonein prepolimero
, 1 mmVWR95039-090
Oxygen Plasma AsherBranson/IPC
Piccolo tubo metallico (0,635 mm OD, 0,4318 mm ID, 12,7 mm di lunghezza); misura del calibro 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
Filtro per siringa Nalgene, 0,22 μ mThermo Scientific725-2520per filtrare tutta la soluzione, piccole particelle ostruirebbero il chip
Tubo in polietilene; 0,9652 mm OD, 0,5842 mm IDSiringa Solomon ScientificBPE-T50
, 1 mlBD Scientificper l'intrappolamento e il rilascio
vermi, 20 mlBD Scientific309661per flusso gravitazionale
Gilson Minipuls 3, peristaltico pompa Gilsonper aspirare soluzioni e vermi dal chip
Regolatore di flusso microfluidico, dotato di 0– Canale di pressione da 800 kPaUscita di pressioneElveflowOB1 MK3
Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 4 mm e diametro esterno di 6 mmCollegamento McMaster-Carr5195 T52dall'aria domestica alla pompa a pressione
Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 2,6 mm e diametro esterno di 4 mmMcMaster-Carr5195 T51collega la pompa a pressione a un tubo piccolo
Raccordo per tubo push-to-connect per ariaMcMaster-Carr5111K468metrico - convertitore imperiale
Connettore diritto per 6 mm × 1/4″ Tubo ODMcMaster-Carr5779 K258
Sistema di microscopia Leica DMI 4000 BLeica
63×/1.32 NA HCX PL APO obiettivo olioLeica506081
Hamamatsu Fotocamera CMOS digitale Orca-Flash 4.0LTHamamatsuC11440-42U
Lumencor Spectra X light engineLumencorCon sorgente luminosa ciano e verde/giallo
Divisore di fascio di eccitazioneChroma59022bsal microscopio
Hamamatsu W-view Gemini Ottica di divisione delle immaginiHamamatsuA12801-01per dividere l'emissione verde e rossa e proiettarle su diverse aree del chip della fotocamera
Divisore di fascio di emissioneChromaT570lpxrnel divisore di immagini
Filtri di emissione GCamp6sChromaET525/50mnello splitter di immagini
Filtri di emissione mCherryChromaET632/60mnello splitter di immagini
per biopsia Corning PDMS 309628 dei

References

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