C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.
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Articolo metodologico
In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso della medicina personalizzata per il trattamento di malattie monogeniche rare come disturbi connessi all'accumulo lisosomiale (LSD) è sfidato da disegni di trial clinici complessi, costi elevati e basso numero di pazienti. Centinaia di alleli mutanti è implicati nella maggior parte delle malattie da accumulo lisosomiale. Le malattie sono in genere classificate in 2 o 3 tipi clinici differenti secondo la severità. Inoltre, caratterizzazione molecolare del genotipo può aiutare a predire gli esiti clinici e informare la cura del paziente. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio di cultura cellulare semplice basato su cellule HEK293H heterologously che sovraesprimono le mutazioni identificate nella malattia di Fabry e Pompe. Un dosaggio simile recentemente è stato introdotto come un test preclinico per identificare mutazioni favorevoli per la terapia Chaperone farmacologici (PCT) nella malattia di Fabry. Questo manoscritto descrive un'analisi di cultura cellulare modificato che consente la rapida valutazione fenotipica delle varianti alleliche nella malattia di Fabry e Pompe per identificare i pazienti eleggibili per PCT e può essere di aiuto nello sviluppo del romanzo pharmacochaperones.
Introduzione
Ci sono oltre una dozzina i disordini da accumulo lisosomiale (LSD) legati alla disfunzione di glycosidase come conseguenza delle mutazioni di gene primario. In Fabry (OMIM #301500) e malattia di Pompe (OMIM #232300), più di 500 e 200 mutazioni di senso sbagliato sono stati segnalati1,2,3 , rispettivamente, che corrisponde a circa il 60% del conteggio totale mutazione. Numerose nuove varianti del gene ancora stanno identificandi, molte delle quali hanno ignoto significato. I vasti studi biochimici hanno rivelato che alcuni genotipi non conducono ad una completa perdita di funzione del gene GLA (OMIM * 300644) nella malattia di Fabry, ma causare l'enzima corrispondente a non riuscire a raggiungere uno stato termodinamicamente favorito pieghevole4 . Ciò provoca ritenzione di ER e degradazione prematura dell'enzima altrimenti funzionale. Simili conclusioni sono state tratte in altre malattie da accumulo lisosomiale, tra cui Pompe malattia5. Inoltre, caratterizzazione molecolare delle varianti di enzima può facilitare l'interpretazione clinica delle mutazioni al momento della diagnosi6, suggerendo che la progressione di LSD è un processo individuale sulla base della natura della mutazione. Di conseguenza, la classificazione convenzionale in diversi tipi clinici in genere 2 o 3 dovrebbe essere rivalutata al fine di ottimizzare la consulenza clinica e le decisioni terapeutiche.
Enzimatica sostitutiva (ERT) è disponibile per entrambe le malattie. ERT, tuttavia, ha limitato l'efficacia nei tessuti/organi colpiti come il cervello e muscolo scheletrico. Inoltre, ERT può suscitare una risposta immunogenica che compromette i suoi benefici terapeutici. Chaperoni farmacologici (pz) sono un'alternativa attraente di trattamento per i pazienti con mutazioni reattive cosiddette. Pz servire come un'impalcatura molecolare per la piegatura della proteina corretta e stabilizzazione che a sua volta impedisce la ritenzione del reticolo endoplasmatico (ER) ed ER-collegata di degradazione dell'enzima. Inoltre, il PC può essere somministrato per via orale e sono potenzialmente in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. Di conseguenza, PCT potrebbe essere un'opzione più praticabile per il trattamento di pazienti con determinati genotipi. Per un'ampia rassegna su applicazione PC nelle malattie da accumulo lisosomiale, consultare l'eccellente recensione di Parenti7.
La scoperta di centinaia di malattia che causa gli alleli del mutante sfida test anti-droga pre-clinica e richiede una valutazione semplice, veloce e altamente standardizzata dei pazienti suscettibili di un approccio di medicina personalizzata. Al fine di valutare gli effetti nocivi delle mutazioni di gene di LSD e di testare le mutazioni candidato per predire i pazienti suscettibili per PCT, è stato un sistema altamente standardizzati over-espressione in cellule di HEK293H che consente la misurazione dell'attività dell'enzima veloce e affidabile sviluppato. Sistemi simili di sovra-espressione precedentemente sono stati descritti per la malattia di Fabry e Pompe utilizzando COS-78,9,10,11, HeLa cellule12o HEK29313 ,14,15,16 celle per il gene di glicosidasi.
Un metodo molto simile è stato brevettato anche come un "metodo per predire la risposta al trattamento farmacologico Chaperone di malattie"17 che indica la pertinenza di una cella cultura sistema in grado di essere integrati nella pratica clinica.
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Protocollo
1. preparazione di costrutti pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA mutante
Nota: Le strategie di clonazione per il GLA e GAA codifica di sequenze (cds) sono stati segnalati precedenti15,18.
- Mutagenesi sito-diretta mediante mutagenesi sito-diretta
- Uso il riferimento sequenze NM_000169.2 e NM_000152.4 come modelli per la mutagenesi dei geni GLA e GAA , rispettivamente. Avere un set di primer gratuito sale ad alta purezza (25-37-mers) sintetizzato da un provider commerciale, con gli iniettori di senso e antisenso che trasportano uno delle modifiche rispettiva sequenza centrale alla loro lunghezza di introdurre individualmente la mutazione. Utilizzare lo strumento di disegno di primer gratuito per sostenere il disegno di primer19.
- Per la miscela di reazione, utilizzare le condizioni standard per la soluzione di reazione e le condizioni PCR fornite dal produttore.
- Mix 5 µ l di tampone di reazione, 10 10x ng modello double-stranded del DNA del plasmide (pcDNA3.1/GLA o pcDNA3.1/GAA), 125 ng di ogni primer, 1 µ l della miscela dei dNTP fornito, 3 µ l di reagente di DMSO in un volume adeguato di acqua deionizzata (volume di reazione finale : 50 Μ L). Infine, aggiungere 2,5 U di DNA polimerasi e Miscelare pipettando su e giù. Come controllo negativo, portare con sé un campione no-primer.
- Avviare la PCR utilizzando il seguente programma: passo 1: 95 ° C per 1 min, passo 2: 95 ° C per 50 s, passo 3: 60 ° C per 50 s, passo 4: 68 ° C per 8 min, ripetere il passaggio 2-4 18 volte e passo 5: 68 ° C per 10 min.
- Dopo la PCR, aggiungere 1 µ l di Dpnho degli enzimi di limitazione (10 U / µ l) e ulteriormente Incubare la fiala di reazione a 37 ° C per 1 h.
- Trasformazione e lo Screening per il Clone desiderato
- Trasformare un'aliquota di cellule ultracompetent in conformità con le raccomandazioni del produttore. Utilizzo medio SOC (tryptone 2% (p/v), lievito estratto di 0,5% (p/v), 10mm di NaCl, KCl 2.5 mM, sterilizzare a 121 ° C e quindi aggiungere soluzioni sterili filtrato di MgCl2 e il glucosio fino a concentrazioni finali di 10 e 20 mM, rispettivamente) invece del produttore medio. Dopo la procedura, piastra 250 µ l della mutagenesi di esempio su un LB piastra contenente 100 ampicillina di µ g/mL e incubare a 37 ° C per 18 ore.
- Assicurare che il numero dei transformants è > 10 e la reazione produce almeno tre volte come molte colonie come la reazione di controllo no-primer, per esempio, usando un piatto luminoso per facilitare il conteggio di Colonia. Poi scegli 3 colonie e preparare 3ml culture durante la notte nel mezzo di libbra di brodo.
- Il giorno successivo, svolgere Miniprep con un kit standard e analizzare l'intera sequenza usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primer tramite standard Sanger sequenziamento.
- Utilizzare uno strumento adatto biologia molecolare per analizzare la sequenza. Quando viene rilevata la mutazione desiderata e nessun ulteriore sequenza anomalia rispetto al NM_000169.2 (α-galattosidasi A) o NM_000152.4 (α-glucosidasi acida) è visto, selezionare il clone per la purificazione del plasmide di transfezione-grado.
- Determinare la purezza del DNA misurando l'assorbanza a uno spettrofotometro.
Nota: Consenti solo i preparativi che producono una purezza del plasmide con un rapporto di assorbanza 260/280 di > 1.8 per cella esperimenti della coltura.
2. coltivazione di cellule HEK293H
- Mantenere le cellule HEK293H in alto glucosio (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina. Mantenere le cellule un incubatore a 37 ° C sotto un 5% CO2 ambiente di pluritubulare.
- Coltivare le cellule ad una densità di 80-90%.
- Il mezzo di aspirare e lavare una volta utilizzando fosfato tampone salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +.
- Passaggio con l'aggiunta di 0.05% tripsina-EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO2.
- Dividere le celle 01:15 in mezzo fresco e il seme in una nuova staffa T75 per mantenere la cultura permanente. Non usare celle con più di 25 passaggi.
3. pcDNA3.1/GLA e pcDNA3.1/GAA plasmide transfezione e trattamento di HEK293H
- 24 h prima la transfezione, lavare le cellule HEK293H in un matraccio di cultura T75 cella una volta con PBS con Ca2 +, Mg2 +. Raccogliere le cellule con 0,05% tripsina-EDTA come indicato sopra e cellule5 seme 1.5 x 10 nelle cavità di una piastra di coltura ben 24 utilizzando 500 µ l DMEM supplementato con 10% FBS senza antibiotici.
- Eseguire un protocollo di transfezione secondo il manuale del produttore. In genere, è possibile utilizzare una miscela di 1 µ g di DNA plasmidico e 2,5 µ l di reagente di transfezione in 100 µ l di DMEM privo di siero. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e aggiungere alle celle in modo sospensione da allora in poi.
- Rimuovere il supporto contenente il reagente di transfezione dopo un periodo di 4 h a 37 °C/5% CO2 e aggiungere 500 µ l di fresco DMEM con 10% FBS / 1% di penicillina/streptomicina.
Nota: Durante questa fase, 1-Deoxygalactonojirimycin cloridrato (DGJ) o 1-Deoxynojirimycin cloridrato (DNJ) potrebbe essere aggiunto al terreno di coltura dove previsto (utilizzare una soluzione acquosa di stock di 10 mM per ottenere una concentrazione finale di 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ o DNJ è stato aggiunto 42h dopo trasfezione di plasmide.
4. cellula raccolto e α-galattosidasi A o la misurazione dell'attività α-glucosidasi acida
- Colture di cellule
- Il giorno della raccolta, rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare il mezzo. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS con Ca2 + e Mg2 +.
Nota: Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono potenti inibitori della α-galattosidasi e α-glucosidasi, rispettivamente, ed eventuali rimanenze invaliderebbe il test. - Aggiungere 200 µ l di acqua deionizzata direttamente sopra le cellule. Sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirli in una provetta di reazione da 1,5 mL.
- Il giorno della raccolta, rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare il mezzo. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS con Ca2 + e Mg2 +.
- Omogeneizzazione di congelamento e scongelamento
- Mettere i campioni in un rack di schiuma appropriata e vortexare per 5 s per rendere più efficiente la lisi. Mettere i campioni alternati in azoto liquido per 10 s e in un bagno di acqua temperatura ambiente fino a quando lo scongelamento era completa (5 min).
- Ripetere questa procedura 5 volte e poi girare i campioni per 5 min a 10.000 x g.
- Preparare una nuova provetta per ciascun campione contenente 40 µ l di deionizzata H2O e aggiungere 10 µ l di campione. Mescolare la soluzione nel Vortex brevemente e trasferire 10 µ l in una cavità di una piastra ben 96 (ogni campione in triplice copia). Diluire una soluzione madre di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL in deionizzata di H2O come indicato di seguito per ottenere una curva standard: 50 µ l di H2O/50 BSA µ l; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; µ L 70 H2O/30 µ l BSA; BSA a 80 µ l H2O/20 µ l; µ L 90 H2O/10 µ l BSA; 100 µ l di H2O.
- Iniziare la reazione aggiungendo 200 µ l di reagente BCA (Reagente A e il reagente B mescolati ad un rapporto di 50: 1) e incubare per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Misurare l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastra.
Nota: I campioni contengono in genere tra 1 e 1,5 µ g di proteine per µ l.
- Diluire la quantità calcolata di ogni campione e dispensare nelle provette di reazione fresco 1,5 mL per ottenere 0,5 (per α-glucosidasi acida) o 0.05 (per α-galattosidasi A) µ g proteine / µ l soluzioni. Vortice i campioni per 5 s nuovo e dispensare 10 µ l di questa diluizione in un 96 ben piatto (ogni campione in duplicato).
- Iniziare la reazione aggiungendo 20 µ l di soluzione substrato rispettivi:
Per α-galattosidasi r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galattopiranoside (4-MU-gal) in tampone citrato di 0,06 M fosfato, pH 4,7.
Per α-glucosidasi acida: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) in acetato di sodio 0,025 M, pH 4,0. - Incubare le reazioni enzimatiche per 1 h al buio a 37 ° C sotto agitazione leggera su agitatore orbitale (300 giri/min). Terminare la reazione con l'aggiunta di 200 µ l di 1,0 M, tampone a pH 10,5 regolato glicina-NaOH.
- Preparare una curva standard di 4-methylumbelliferone (4-MU) da uno stock di 0,01 mg/mL come segue:
100 µ l di H2O / no 4-MU; 80 µ l di H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l di H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; No di H2O / 100 µ l 4-MU, dispensare 10 µ l di ciascuna diluizione nel pozzo 96 piastra (in duplicato) e aggiungere 200 µ l di buffer di glicina-NaOH 1,0 M in ciascun pozzetto al fine di regolare il volume e il pH. - Misura l'attività dell'enzima in un lettore di fluorescenza con il set di filtri appropriati e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per la periferica del lettore di fluorescenza.
Nota: Entrambi i substrati 4-MUG sono ridotti a 4-MU durante l'esposizione al α-galattosidasi A o α-glucosidasi acida. Rilasciato 4-MU è un fluorocromo, che può essere misurato a 360 e 465 nm come lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza.
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Risultati
La procedura di mutagenesi
Per valutare l'efficienza di mutagenesi gene GLA , le mutazioni sono state classificate in una delle categorie seguenti. Questo approccio per generare mutazioni ha rivelato che circa il 66,5% delle mutazioni GLA sono stati ottenuti nel primo tentativo. Un ulteriore 25% potrebbe essere ottenuto dopo una PCR seconda leggermente modificata.
Categoria 1: La mutagenesi ...
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Discussione
Il protocollo descritto nel presente documento fornisce risultati affidabili per la valutazione dei danni degli enzimi in malattie lisosomiali ereditarie del metabolismo. Questo manoscritto è che un emendamento al protocollo pubblicato precedenti15. Le modifiche più cruciale coinvolgono stringenza (cioè, nel processo di preparazione del costrutto di mutante vettoriale), standardizzazione del protocollo di cultura di cellule (cioè, condizioni di manutenzione e di transfezione dell...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare Mandy Loebert e Tina Czajka per supporto tecnico eccellente. Ringraziamo Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) per la lingua modifica Guida.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| Kit di mutagenesi sito-diretto QuikChange II XL | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germania | n.a.Tryptone | |
| Carl Roth, Karlsruhe, Germania | 8952.1 | ||
| Estratto di lievito | Merck, Darmstadt, Germania | 103.753 | |
| Cloruro di sodio | Merck, Darmstadt, Germania | 1.064.041.000 | |
| Cloruro di potassio | Merck, Darmstadt, Germania | 1.049.360.500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germania | 1.058.330.250 | |
| D (+)-Glucosio monoidrato | Merck, Darmstadt, Germania | 1.083.422.500 | |
| Idrossido di sodio | Merck, Darmstadt, Germania | 1.064.980.500 | |
| Glicina | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | 3908.2 | |
| Acido citrico | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | X863.3 | |
| idrogeno fosfato disodico | Merck, Darmstadt, Germania | 1.065.860.500 | |
| Acetato di sodio | Merck, Darmstadt, Germania | 1.062.640.050 | |
| Acido acetico glaciale | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | X969,2 | |
| LB Medio | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | X968,2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Friburgo, Germania | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germania | 12245 | |
| HEK293H linea cellulare | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 11631-017 | |
| Dulbecco&acuto; s Aquila modificata media | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 31966-047 | |
| Siero fetale bovino HyClone | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillina/streptomicina | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 15140-122 | |
| Palloni standard CELLSTAR per colture cellulari, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germania | 82050-854 | |
| Piastre per colture cellulari (24 pozzetti | )Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | 831.836 | |
| Piastra a 96 pozzetti Cellstar | Greiner bio one, Frickenhausen, Germania | 655185 | |
| Provette di reazione SafeSeal, 1,5mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | 72.706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 11668-019 | |
| 1-Deossigalattojirimicina cloridrato | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | D9641 | |
| 1-desossigalattojirimicina cloridrato | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-deossinojirimicina | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | D9305 | |
| PBS Dulbecco senza calcio, senza magnesio | Biochrom, Berlino, Germania | L 1825 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Thermo Scientific, Braunschweig, Germania | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germania | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | M1381 | |
| 4-metilumbelliferile &alfa;-D-galattopiranoside | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | M7633 | |
| 4-metilombrelliferile &alfa;-D-glucopiranoside | Sigma Aldrich, Monaco di Baviera, Germania | M9766 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a.Luminous | |
| Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germania | n.a.GFL-3032 | |
| agitatore batterico | GFL, Burgwedel, Germania | n.a.Avanti | |
| J-25 centrifuga | Beckman/Coulter, Krefeld, Germania | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro Spettrofotometro | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Regno Unito | n.a.water-jacket | |
| incubator | Binder, Tuttlingen, Germania | n.a.Vortex | |
| Genie 1 miscelatore a sfioramento | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a.Z | |
| 233 MK-2 centrifuga a microprovette refrigerata | Hermle, Tuttlingen, Germania | n.a.Dispositivo | |
| per acqua ultrapura LaboStar | Siemens, Berlino, Germania | n.a.Agitatore | |
| termico PST-60HL-4 agitatore orbitale | Biosan, Riga, Lettonia | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, Svizzera | n.a.HI | |
| 223 Misuratore di pH a microprocessore | HANNA Instruments, Arvore, Portogallo | n.a.CASY | |
| br/> Contatore di cellule + Sistema di analisi Modello TT | Innovatis AG, Cham/Zug, Svizzera | ||
| Name | >Azienda | Numero di catalogo | >Commenti |
| Software | |||
| Magellan software di analisi dei dati v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, Svizzera | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a.Microsoft | |
| Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a.BioEdit | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = non applicabile |
Riferimenti
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- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
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