Lente-libero video microscopia permette di monitorare le colture cellulari direttamente all'interno dell'incubatrice. Qui descriviamo il protocollo completo utilizzato per acquisire e analizzare un'acquisizione di 2,7 giorni lunghi delle cellule coltivate di HeLa, che conduce a un dataset di 2.2 x 106 misurazioni della morfologia delle cellule individuali e ciclo cellulare 10584 tracce.
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Articolo metodologico
Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, dimostriamo che lente-libero video microscopia permette di catturare simultaneamente la cinetica di migliaia di cellule direttamente all'interno dell'incubatrice e che è possibile monitorare e quantificare singole cellule lungo diversi cicli cellulari. Descriviamo il protocollo completo utilizzato per monitorare e quantificare una coltura delle cellule HeLa per 2,7 giorni. In primo luogo, acquisizione di cultura cellulare viene eseguita con un microscopio obiettivo-libero video, e quindi i dati vengono analizzati seguendo un processo in quattro fasi: rilevazione delle cellule segmentazione e la divisione cellulare delle cellule-rilevamento, ricostruzione olografica di multi-lunghezza d'onda, algoritmi. Di conseguenza, mostriamo che è possibile raccogliere un dataset con più di 10.000 brani del ciclo cellulare e più di 2 x 106 cella misurazioni morfologiche.
Introduzione
Cellule di mammiferi coltivate nel corso di diversi cicli cellulari di monitoraggio e misurazione con precisione dimensioni delle celle e celle massa secca è un compito impegnativo. Diverse tecniche ottiche privo di etichetta sono in grado di eseguire questo compito1,2: uno spostamento di fase interferometria3, microscopia digitale oleografica (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale taglio interferometria8,9
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Protocollo
1. cella cultura monitoraggio acquisizione
- Crescere le cellule HeLa in DMEM + glutammina (ad es., GlutaMAX) supplementato con 10% (v/v) fetale di vitello inattivato per calore del siero e l'1% penicillina e streptomicina.
- Cappotto lastre di cultura di fondo 6 pozzetti vetro con fibronectina (25 µ g/mL) per 1 h. Allora seed 2 x 104 cellule per pozzetto.
- Durante l'acquisizione, cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
- Per l'acquisizione di time-lapse, utilizzare il video microscopio obiettivo-gratuita (disponibile in commercio).
Nota: Questo si basa la tecnica di imaging privo di lente computazionale come descritto ....
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Risultati
Per il processo di ricostruzione olografica, il campo di luce è descritta da un campo scalare A (dove 
è il valore complesso di A sull'aereo a distanza z dalla posizione del campione e laterale 
e a lunghezza d'onda λ). Propagazione della luce è modellato con la teoria di Huygens-Fresnel che fornisce un kernel propagatore
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Discussione
In questa carta, indichiamo che lente-libero video microscopia può essere utilizzato all'interno di un'incubatrice per catturare la cinetica di migliaia di celle. Al fine di descrivere la metodologia globale che abbiamo spiegato come un'acquisizione di time-lapse 2,7 giorno delle cellule HeLa in cultura possa essere analizzati con algoritmi di rilevamento delle cellule standard. Il risultato è un set di dati con 2.2 x 106 cella misure e 10.584 tracce del ciclo cellulare. Le acquisizioni sono state effettuate s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nulla a riconoscere.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Videomicroscopio senza lenti Cytonote | Software di acquisizione Iprasense | ||
| Horus | Iprasense | ||
| MatTek corporation | Numero del pezzo: P06G-0-14-F | ||
| DMEM + GlutaMAX medio | inattivato a caldo Gibco | ||
| Eurobio | |||
| penicillina e streptomicina | Gibco | ||
| Fibronectina | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, cassetta degli attrezzi per l'elaborazione delle immagini | Mathworks |
Riferimenti
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).....
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Ristampe e permessi
